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耐高温碱性杲胶酶在医药、纺织和植物纤维加工、油提取、含果胶工业废水处理等领域具有广泛应用。酶法提取中药有效成分的技术中,果胶酶可以破坏植物细胞壁中的果胶,有助于有效中药成分的释放。用果胶酶提取中药有效成分不仅经济、环保,而且也更为高效。从短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus, ATCC7061)克隆得到的碱性呆酶,在最适条件下活性高,反应pH高,但是它在高温条件下不稳定。枸杞是(Fructus Lycii)中国传统的名贵中药材和食品,具有调节免疫、抗衰老、抗肿瘤、明目等多种生理功能。近年来研究发现,枸杞具有的药理和保健作用与其所含有的多糖物质密切相关。不少学者用水提取、超声提法、碱提法等多种方法对枸杞多糖进行提取。本论文利用定向进化的方法来提高从短小芽孢杆菌中的碱性果胶酶的热活性和热稳定性,提高了其应用价值,并运用于提取枸杞多糖,为中药提取有效成分提供了一个新的思路。论文取得的实验结果有：1、碱性果胶酶基因的克隆将短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus, ATCC7061)的果胶酶基因克隆,构建重组质粒pET28a-pel。在大肠杆菌中BL21(DE3)进行表达,表达后的重组蛋白大小为37kDa。2、DNA的文库构建和突变体的筛选运用定点突变和全质粒扩增(Megawhop)的方法构建Pel的6个定点突变体,用聚半乳糖醛酸(PGA)作为底物进行筛选,发现一个合适的突变位点R227,并且继续饱和突变R227位点,得到一个比野生型较优良突变体R227W,以R227W为模板,运用易错PCR (error-prone PCR)和全质粒扩增的方法构建新的随机突变库,得到了2个更优良的突变体12E4(S145C,R227W)和13E8(T206A,R227W),12E4比R227W具有更高的热活性,而13E8比R227W具有更好的热稳定性。利用定点突变的方法,将3个优良的突变位点都整合到野生型中,得到新的突变体M3 (S145C, T206A, R227W)。3、野生型碱性果胶酶和突变体的对比突变体M3对聚半乳糖醛酸(PGA)的比活力相对于野生型(WT)提高了3.4倍。在50℃条件下,野生型碱性果胶酶的半衰期不到10分钟,而M3的半衰期则超过13个小时。同时,M3的最适反应温度也比野生型上升100C,达到75℃。从酶动力学参数比较,M3的催化效率kcat/Km仇于野生型的碱性果胶酶(WT)。4、酶法提取枸杞多糖将野生型碱性果胶酶和突变体M3应用于提取枸杞多糖。从枸杞多糖的提取效率来看,M3比野生型更好,在60℃,pH10.0,反应2小时条件下,M3的提取率为4.3%,野生型碱性果胶酶的为3.0%,碱液组(Buffer)为1.8%,水提组为1.1%。碱性环境中加入碱性果胶酶,更有利于枸杞多糖的提取。