论文部分内容阅读
研究背景肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome,IBS)是一种以腹痛、腹胀和排便习惯改变为表现的功能性胃肠病,根据临床症状的差异,IBS可分为以下亚型:腹泻型(Diarrhea-Predominant IBS,IBS-D),便秘型,混合型及未定型。IBS的发病机制复杂且病因并未完全阐明,肠道菌群失衡可能与IBS发病有关,相关研究也指出益生菌的应用可以缓解IBS患者的临床症状。然而既往研究中菌群测序结果有很大异质性,需更多研究进一步证实。动物实验指出不同肠段的肠道菌群存在差异,且发现盲肠内容物中短链脂肪酸(Short Chain Fatty Acids,SCFAs)的浓度明显高于远端结肠。SCFAs作为肠道菌群的代谢产物,可以刺激肠嗜铬(Enterochromaffin,EC)细胞上调色氨酸羟化酶1(Tryptophan Hydroxylase 1,TPH1)的表达进而增加 5-羟色胺(5-Tydroxytryptamine,5-HT)的产生。5-HT是体内一种重要的神经递质,人体内绝大部分的5-HT由EC细胞产生,可参与调节肠道动力以及内脏高敏感,与IBS的发病关系密切。临床研究发现人体盲肠内容物的菌群丰度比回肠末端内容物高100倍,且人的盲肠内容物与粪便之间存在菌群差异。结肠理化条件较稳定,结肠菌群个体间稳定性较强,除此之外,结肠的EC细胞表达多种受体,可直接感知来自肠道菌群代谢物的刺激,因此对结肠黏膜的菌群加以研究十分必要。检索文献发现,目前尚没有关于盲肠与结肠黏膜菌群在IBS患者中对比的相关研究。研究目的1.评估IBS-D患者及健康查体者(Health Controls,HCs)之间的黏膜菌群差异;2.评估IBS-D患者及HCs中的EC细胞数目及TPH1及达情况;3.评估盲肠及降结肠的EC细胞数目及菌群丰度是否存在差异;4.评估IBS-D患者中肠道菌群丰度与各环境因子之间是否存在相关性。研究方法1.纳入自2019年3月至2019年7月于山东大学齐鲁医院行无痛肠镜的HCs以及IBS-D患者。收集研究对象的基本信息,盲肠及降结肠黏膜样本。2.免疫荧光计数EC细胞数目:一抗选用兔来源抗chromogranin A抗体进行免疫荧光染色,于荧光显微镜下观察,随机选取5个200 x视野进行EC细胞计数。3.实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)及蛋白印迹(Western Blotting)测定TPH1的表达:应用一步法提取组织的RNA及蛋白,RNA逆转录后进行RT-PCR测定TPH1水平。Western Blotting的一抗选用兔来源抗TPH1抗体,通过发光液显色曝光。4.黏膜菌群测序:提取活检组织DNA后进行16S rRNA基因测序,分析各组之间肠道菌群丰度。除此之外,通过斯皮尔曼相关性分析对菌群相对丰度与EC细胞数目、腹痛程度、腹痛频率、排便频率、汉密尔顿焦虑评分(Hamilton Anxiety Scale,HAM-A)、汉密尔顿抑郁评分(Hamilton Depression Scale,HAM-D)、IBS-严重程度评分(IBS Severity Scores,IBS-SSS)进行相关性分析。研究结果1.本研究纳入22名IBS-D患者以及22名HCs。IBS-D患者组与HCs组在年龄、性别、BMI之间无明显差别,但IBS-D患者的HAM-A以及HAM-D评分均较HCs高,排便频率较HCs增加(P<0.0001)。2.免疫荧光结果提示IBS-D患者组盲肠处的EC细胞数目较HCs组增多(P<0.05),降结肠处的EC细胞数目较HCs组有增多趋势(P=0.08);盲肠与降结肠的EC细胞数目之间无明显差异。3.RT-PCR结果提示转录水平IBS-D患者降结肠与盲肠的TPH1水平均高于HCs(P<0.05),而盲肠与降结肠之间对比无明显差异。Westernblotting结果提示蛋白水平IBS-D患者降结肠与盲肠的TPH1水平高于HCs(P<0.05),而盲肠与降结肠对比无明显差异。4.黏膜测序结果提示IBS-D患者与HCs在降结肠、盲肠处的菌群多样性均无明显差异。优势菌属中IBS-D患者降结肠与HCs降结肠相比,torques型瘤胃球菌属及Dorea的相对丰度增加(5.94%vs.2.29%,P=0.04183;2.68%vs.1.14%,P=0.04962),梭杆菌属相对丰度下降(1.52%vs.1.89%,P=0.0345);IBS-D患者盲肠与HCs盲肠相比,torques型瘤胃球菌属相对丰度增加(4.91%vs.2.20%,P=0.04763),梭杆菌属及拉乌尔菌属相对丰度下降(1.58%vs.1.76%,P=0.03117;0.12%vs.1.66%,P=0.01892)。但是,IBS-D患者的盲肠与降结肠之间以及HCs的盲肠与降结肠之间的菌群丰度均无明显差异。斯皮尔曼相关性分析提示torques型瘤胃球菌属的相对丰度与EC细胞数目(r=0.49,P=0.047),IBS-SSS(r=0.65,P=0.004),HAM-A(r=0.66,P=0.004),HAM-D(r=0.61,P=0.009),腹痛程度(r=0.63,P=0.007),腹痛频率(r=0.63,P=0.007),排便频率(r=0.60,P=0.011)呈正相关。Dorea菌属的相对丰度与EC细胞数目(r=0.57,P=0.018),IBS-SSS(r=0.52,P=0.034),HAM-A(r=0.72,P=0.001),HAM-D(r=0.59,P=0.012),腹痛频率(r=0.67,P=0.003)呈正相关。研究结论IBS-D患者盲肠处EC细胞数目较HCs增多,并且降结肠及盲肠处TPH1表达水平均上调。IBS-D患者盲肠与降结肠处torques型瘤胃球菌属,降结肠处Dorea的相对丰度较HCs增高,且与EC细胞数目,IBS-D患者症状评分,HAM-A,HAM-D均呈正相关,可作为IBS-D患者后续研究的潜在靶点。