胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,严重危害人类的健康,其发病率居世界第五位,死亡率居世界第三位。世界上每年约有一百万例新发胃癌患者,发展中国家发病患者约占2/3,约有42%的胃癌患者发生在中国。早期诊断和治疗对胃癌患者的病情以及预后具有重要意义,这也成为目前胃癌研究的热点问题。从胃癌的整个发展演变过程来看,涉及到多基因的异常调节和多步骤的参与,最终引起细胞生物学行为出现异常。越来越多的研究发现,基因对胃癌的发生发展具有很大影响。在胃癌患者的人体中某些基因与正常人体之间的遗传相关性发生了改变,这些变异基因可能是引起胃癌发生的关键。如果异常细胞行为所产生的改变是基于基因层面,那么将会引起细胞的结构和功能产生不可逆的改变,由此引发相关细胞发生癌变。此外,肿瘤的复发和远处转移是导致胃癌患者死亡的最主要原因,对胃癌患者的治疗和预后具有重要影响。因此,对胃癌的发病和转移机制进行深入研究,可为胃癌的早期诊断和预后评估提供理论依据,同时也为探索胃癌新的诊断方法以及发现新的治疗靶点提供理论基础。以前对于胃癌的研究主要集中在蛋白质编码基因上,主要涉及表观遗传学、遗传学和相关信号通路的调控。随着高通量测序技术的发展,研究人员发现,人类基因组中非编码RNA(Non-coding RNA,ncRNA)的比例占95%以上,蛋白质编码RNA与功能性非编码RNA之间的复杂相互作用对胃癌的发生和发展中起着重要作用。长链非编码(long non-coding RNA,lncRNA)作为ncRNA的重要组分之一,正受到越来越多的关注。长链非编码RNA一般位于细胞核内或细胞浆内,转录本长度一般都大于200个核苷酸,很少参与蛋白的编码,主要以RNA的形式在表观遗传、转录、转录后水平调控基因的表达。LncRNA参与基因组印记、染色质修饰、染色体沉默、mRNA转录激活及干扰、转录后的调控、调节原癌基因活化、核内运输等重要的调控过程。它不仅可以激活某些蛋白质编码基因的表达,还可以抑制蛋白质编码基因的表达。近年来,长非编码RNA在肿瘤机制的研究中受到越来越多的关注。到目前为止,已有许多lncRNA与肿瘤细胞增殖、侵袭、转移以及复发等密切相关。在先前的胃癌研究中,有研究报道在胃癌组织和邻近的正常非肿瘤组织中具有明显差异表达的lncRNA。一些lncRNA如HULC、H19可通过调节下游靶基因影响胃癌细胞的增殖和侵袭能力,从而导致胃癌的发生和发展。目前关于lncRNA在胃癌中的研究尚处于起步阶段,探索和发现新的lncRNA及其特异性调控机制,可为研究胃癌的发病机制提供新的理论依据。本研究中我们利用生物信息学分析、高通量测序结合经典分子生物学技术等,在分子水平、细胞水平、以及临床样本中探索长链非编码RNA lnc-Z38对胃癌生物学效应的影响及相关机制。第一部分 lncRNAZ38在胃癌组织和细胞株中的表达及其临床意义研究背景胃癌是目前世界上最常见恶性肿瘤之一。在中国,男性胃癌的发病率居所有恶性肿瘤发病率的第二位,女性发病率居第五位,严重危害我国国民健康。胃癌的发生和发展需要经历一个多阶段、多种因素参与的过程。最近的研究表明,长链非编码RNA与肿瘤的发生和发展密切相关,它可以在转录、转录后和翻译水平上调节肿瘤相关基因的表达。目前,已发现胃癌组织中存在多种异常表达的lncRNA,并且这些异常表达的lncRNA对胃癌的发生和发展发挥重要的调控作用。然而,关于lncRNA在胃癌中的具体作用机制尚未完全阐明,还有待于进一步探讨。方法及结果我们对5对胃癌病人的癌组织及癌旁组织进行了 lncRNA表达谱高通量测序的检测。通过生物信息学分析发现lncRNAZ38在胃癌组织中显著高表达;采用qPCR技术在100例胃癌及癌旁组织中验证,证实了 lncRNAZ38在胃癌组织中高表达;分析lncRNAZ38表达水平与1 00例胃癌患者临床病理参数的关联性,我们发现lncRNAZ38的表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、远处转移显著相关,与性别、年龄无关。同时,我们对正常胃黏膜上皮细胞株(GES-1)和胃癌细胞株(KATO Ⅲ、SGC 7901、AGS、MKN45、MKN74)进行qPCR检测lncRNAZ38的表达,发现与正常胃黏膜上皮细胞相比,胃癌细胞系的五种癌细胞lnRNAZ38均呈现高表达。小结本研究发现与癌旁组织相比,lncRNAZ38在胃癌组织中表达水平显著升高(p<0.05),且表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、远处转移具有显著相关性。与正常胃黏膜上皮细胞相比,胃癌细胞中lnRNAZ38呈现高表达。这为lncRNAZ38作为评价胃癌发展进程、预后评估以及作为潜在肿瘤标志物提供重要参考,也为进一步深入研究lncRNAZ38在胃癌中的作用及其调控机制提供依据。第二部分 lncRNAZ38对胃癌细胞生物学效应的影响研究背景肿瘤的发生和发展受多种因素的影响,与基因密切相关。肿瘤的转移是导致恶性肿瘤患者死亡的最主要的原因,占肿瘤相关死亡率的90%以上。远处组织或器官转移是癌症患者预后不良的一个重要标志。肿瘤的发生、发展以及转移是非常复杂的过程,包含肿瘤细胞的生长,转化,侵袭,扩散、血管生成以及随后的粘附和定植,涉及许多不同的基因和途径。长链非编码RNA长期以来被认为是没有蛋白质编码能力的非功能性序列。近年来,越来越多的研究发现lncRNA可以在转录,转录后和翻译水平上调节基因表达以发挥生物学功能,影响肿瘤细胞的定植、侵袭、凋亡和转移等生物学效应。前面的实验我们发现lncRNAZ38在胃癌组织中显著高表达且表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、远处转移具有显著相关性,同时前期研究发现lncRNAZ38在乳腺癌中表达增高,是乳腺癌不良预后的指标,那么接下来我们研究lncRNAZ38对胃癌细胞增殖、侵袭、凋亡等生物学效应的影响。方法及结果1、成功构建干扰lncRNAZ38的胃癌细胞株AGS细胞和MKN74细胞。2、CCK-8及平板克隆形成实验发现干扰lncRNAZ38表达的胃癌细胞株AGS和MKN74细胞的增殖能力及克隆形成能力显著减弱。3、Trans-well实验及划痕实验发现干扰lncRNAZ38表达的胃癌细胞株AGS和MKN74细胞的迁移和侵袭能力显著减弱。4、流式细胞凋亡检测及相关的半胱天冬酶相对活性测定发现干扰lncRNAZ38表达后通过增加caspase-3和caspase-9的活性来促进细胞凋亡。小结本研究初步证明lncRNAZ38能够促进胃癌细胞增殖、侵袭及转移并抑制胃癌细胞的调亡。第三部分 lncRNAZ38参与胃癌发生发展的分子机制初步探讨研究背景既往关于胃癌发生、发展的分子机制研究主要集中在传统的蛋白质编码基因上,主要涉及表观遗传学、遗传学和相关信号通路的调控等方面。近年来,随着高通量测序技术的发展,非编码RNA,特别是长链非编码RNA,在肿瘤机制研究中受到越来越多的关注。到目前为止,据报道许多lncRNA与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移以及复发密切相关。同样,在胃癌的研究中,已发现胃癌组织与癌旁正常组织中有多种明显差异表达的lncRNA,并且一些lncRNA如H19等可通过不同的机制调控下游靶基因对胃癌细胞的增殖或侵袭能力产生影响,进而促进胃癌的发生和发展。目前,关于lncRNA在胃癌中的研究尚处于起步阶段,因此探索和发现新的lncRNA,研究其分子调控机制,可为研究胃癌的发病机理提供新的研究方向和理论基础。前面的实验我们发现lncRNAZ38可促进胃癌的浸润、转移,抑制胃癌细胞的凋亡,接下来我们研究lncRNAZ38对胃癌发生、发展进行调控的分子机制。方法及结果1、成功构建稳定过表达lncRNAZ38的胃癌细胞株AGS细胞和MKN74细胞。2、将稳定过表达lncRNAZ38的胃癌细胞株AGS和其平行对照细胞进行高通量测序。根据检测结果结合生物信息学分析我们初步预测lncRNAZ38可通过TGF-beta信号通路对胃癌进行调控作用。3、我们选取TGF-beta信号通路中上调基因ID3、BMP6,下调基因GDF-5进行验证。通过Western Blot检测,结果与高通量测序结果相一致,说明lncRNAZ38可通过TGF-beta信号通路对胃癌进行调控作用。小结本研究发现lncRNAZ38可通过TGF-beta信号通路对胃癌发挥调控作用,从而影响胃癌的发生、发展进程。