目的:1.研究自然流产患者与正常早孕人工流产者母胎界面绒毛组织和蜕膜组织中的差异表达miRNA,探讨差异表达miRNA在自然流产中的作用;2.研究自然流产患者与正常早孕人工流产者母胎界面绒毛组织和蜕膜组织中的差异表达基因,探讨差异基因在自然流产中的作用;3.验证自然流产患者与正常早孕人工流产者绒毛组织内miR-198、自噬相关基因ATG9B、ATG16L1以及自噬标志物LC3Ⅱ、p62表达差异;4.构建流产大鼠模型,研究减味寿胎丸通过调控母胎界面ATG9B、ATG16L1介导自噬功能的安胎机制。5.构建米非司酮诱导滋养细胞损伤模型,探索减味寿胎丸调控母胎界面自噬功能的潜在分子机制。方法:1.通过伦理审批,根据纳排标准,收集自然流产患者以及正常早孕人工流产者的同源绒毛组织和蜕膜组织各5对,通过miRNA芯片测序技术,筛选自然流产组织中的差异表达miRNA。2.对纳入miRNA芯片测序的同源组织进行转录组高通量测序,进一步筛查自然流产绒毛组织和蜕膜组织中的差异表达mRNA及其相关调控网络。3.收集满足纳排标准的临床组织,通过RT-PCR方法检测自然流产患者和正常早孕者绒毛组织中miRNA-198及其靶基因ATG9B、ATG16L1的表达,然后通过免疫组化、Western Blotting等技术检测ATG9B、ATG16L1和自噬标志蛋白的表达。4.按照菟丝子:桑寄生:续断=2:1:1的配比提取减味寿胎丸冻干粉。利用UPLC/Q-TOF-MS技术分别在正负离子模式下检测减味寿胎丸的有效成分。5.构建流产大鼠模型,记录孕鼠体重增长变化情况,计算孕鼠流产率,测量胚胎直径并在体视镜下观察胚胎形态学变化。利用RT-PCR检测孕鼠子宫胚胎结合位点组织中ATG16L1、ATG9B mRNA的表达,HE染色观察结合位点的形态学变化,免疫组化以及Western Blotting检测结合位点ATG16L1、ATG9B以及自噬标记蛋白的表达。6.构建米非司酮诱导滋养细胞损伤模型,观察减味寿胎丸及其有效成分川续断皂苷Ⅵ对miR-198的调控作用。7.过表达以及沉默滋养细胞中的miR-198,观察细胞自噬水平的变化。8.通过双荧光素酶报告基因实验,对miR-198与ATG9B以及miR-198与ATG16L1之间的靶向调节关系进行验证。结果:一、自然流产和正常早孕母胎界面差异表达miRNA筛选1.总共选取5对同源绒毛组织和蜕膜组织进行miRNA测序,自然流产组年龄为28.80±4.49岁,孕周7.60±0.24周;人工流产组年龄为27.40±5.03岁,孕周7.20±0.37周。两组志愿者在年龄、孕周、产次、流产次数等方面比较,差异无统计学意义（P>0.05）。2.以正常早孕人工流产组织作为对照,分别对自然流产绒毛组织和蜕膜组织进行miRNA芯片测序,得到了两种组织的差异表达miRNA。其中在自然流产绒毛组织中发现表达上调miRNA 12个,表达下调miRNA 23个,合计35个差异表达miRNA。其中在自然流产绒毛组织中过表达的前10个miRNA分别是:hsa-miR-1273c、hsa-miR-4299、hsa-miR-4653-3p、hsa-miR-4721、hsa-miR-6808-5p、hsa-miR-363-5p、hsa-miR-6782-5p、hsa-miR-3663-5p、hsa-miR-8078、hsa-miR-7641;而自然流产绒毛组织中低表达的前10个miRNA分别是hsa-miR-744-3p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-449b-3p、hsa-miR-1234-3p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-4701-5p、hsa-miR-3151-3p、hsa-miR-3133、hsa-miR-6508-5p。在这些 miRNA中,hsa-miR-744-3p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-4668-5p 的差异表达倍数最大,且均为表达下调miRNA。而在蜕膜组织中,自然流产组与对照组相比较,共有155个表达上调miRNA,38个表达下调miRNA,合计193个差异表达miRNA。其中在自然流产蜕膜组织中过表达的前10个miRNA分别是:hsa-miR-2278、hsa-miR-595、hsa-miR-6754-3p、hsa-miR-3064-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-3148、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-4455、hsa-miR-5096、hsa-miR-32-3p;而表达下调的前10 个 miRNA 分别是 hsa-miR-1247-3p、hsa-miR-3714、hsa-miR-513a-5p、hsa-miR-4454、hsa-miR-6864-5p、hsa-miR-6782-5p、hsa-miR-942-3p、hsa-miR-4653-3p、hsa-miR-363-5p、hsa-miR-1225-5p。在这些 miRNA 中,差异表达倍数最大的 miRNA是 hsa-miR-1247-3p（↓）、hsa-miR-1247-3p（↑）、hsa-miR-595（↑）。3.分别对自然流产绒毛组织和蜕膜组织中差异表达倍数最大的前10个miRNA进行靶基因预测并进行KEGG富集通路分析,结果显示自然流产绒毛组织中差异表达倍数最大的miRNA靶基因主要富集在Hippo信号通路、癌症相关通路、TGF-beta信号通路、黏合连接、乙型肝炎等通路,其中Top通路是Hippo信号通路。而自然流产蜕膜组织中差异表达倍数最大的前10个miRNA靶基因主要富集在Hippo信号通路、甲状腺激素信号通路、Wnt信号通路等通路,其中Hippo信号通路为Top通路且富集的靶基因最多。二、自然流产和正常早孕母胎界面差异表达mRNA筛选1.通过比对正常早孕人工流产组织mRNA表达谱,在自然流产绒毛组织中发现1596个差异表达基因,其中表达上调基因937个,表达下调基因659个。自然流产绒毛组织中过表达的前10个基因分别是:EIF1AY、DDX3Y、RPS4Y1、USP9Y、KDM5D、UTY、TTTY15、CHRDL2、CXCL8、C2orf54;而自然流产绒毛组织中表达下调的前10基因是分别是GYPB、CTSE、HBZ、GYPA、GYPE、AHSP、PKLR、HBM、ALAS2、CRHBP。在这些差异基因中,EIF1AY、DDX3Y、RPS4Y1的差异表达倍数最大,且均为过表达基因。而自然流产蜕膜组织与正常早孕人工流产蜕膜组织相比较,共发现5201个差异表达基因,其中过表达基因3015个,表达下调基因2186个。在这些差异表达基因中,前10个过表达基因分别是:PDE4C、EEF1AKMT4、CD300H、LMLN2、FAM169B、BISPR、LINC00506、N4BP2L2-IT2、LINC00836、LINC00294;而前 10 个表达下调基因分别是 CFH、STPG1、NIPAL3、LAP3、HS3ST1、AOC1、TMEM176A、M6PR、CYP26B1、ICA1。其中 PDE4C、EEF1AKMT4、CD300H差异表达倍数最大,均为过表达基因。2.通过Venn图工具对两种自然流产组织的差异表达基因进行分析,结果显示,在自然流产绒毛组织和蜕膜组织中均过表达的基因有415个,均表达下调的基因有125个,合计540个差异表达基因。对这些差异基因进行GO分析和KEGG分析后发现,差异表达基因GO分析结果主要集中在免疫方面,与中性粒细胞的功能密切相关。而从KEGG富集的通路来看,大多也都富集在跟免疫相关的通路上,如细胞因子和细胞因子受体相互作用（hsa04060）、TNF信号通路（hsa04668）、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路（hsa04933）、类风湿性关节炎（hsa05323）、凝血与补体级联反应信号通路（hsa04610）等等。三、自然流产绒毛组织中miR-198及靶基因ATG9B、ATG16L1的表达1.共纳入66名符合研究纳排标准的志愿者,其中自然流产组绒毛组织33例,对照绒毛组织33例。正常早孕人工流产组年龄为26.6±5.1岁,BMI为20.8±1.8 kg/m2,而自然流产组年龄为30.0±5.1岁,BMI为22.3±2.4 kg/m2,两组在年龄与BMI方面相比较,差异均有统计学意义（P<0.05）,提示自然流产发生的风险随着母亲年龄的增长以及BMI指数的升高而增加。此外,两组在孕周、妊娠次数、产次、流产次数等方面相比较,差异均未见统计学意义（P>0.05）。2.has-miRNA-198在正常早孕人工流产者和自然流产患者绒毛组织中的表达存在差异,其在自然流产绒毛组织中表达下调。3.与正常早孕人工流产绒毛组织相比,ATG16L1、ATG9B、ATG5、LC311 mRNA在自然流产绒毛组织中表达上调。4免疫组化结果提示,与正常早孕人工流产绒毛组织相比,自然流产绒毛组织中ATG16L1、ATG9B、LC3Ⅱ表达上调。5.Western Blotting结果显示自然流产组绒毛组织中ATG16L1、ATG9B、LC3Ⅱ/Ⅰ较正常早孕人工流产者组的表达上调,p62表达下调,提示了自然流产绒毛组织中自噬活性发生变化。四、基于流产大鼠模型探讨减味寿胎丸调控自噬的机制研究1.使用Masslynx软件对UPLC/Q-TOF-MS技术在正负离子模式下检测到的减味寿胎丸成分与标准品的保留时间以及精确质量数进行比对,鉴定减味寿胎丸的有效成分。在正离子模式下,11种成分在减味寿胎丸中的保留时间分别为:绿原酸4.68 min、马钱苷5.77 min、当药苷5.88 min、芦丁 7.84 min、金丝桃苷8.07 min、萹蓄苷9.08 min、槲皮苷9.32 min、槲皮素11.88 min、川续断皂苷Ⅵ 12.16 min、山奈酚12.63 min、异鼠李素12.75 min。在负离子模式下,各组分保留时间为:绿原酸4.69 min、马钱苷 5.76 min、当药苷 5.86 min、芦丁 7.84 min、金丝桃苷 8.07 min、萹蓄苷9.08 min、槲皮苷9.3 min、槲皮素11.89 min、川续断皂苷Ⅵ12.19 min、山奈酚12.63 min、异鼠李素12.76 min。2.各干预组孕鼠流产率的统计结果显示,与阴性对照组比较,模型对照组的流产率明显升高,均数为50.15%,差异有统计学意义（P<0.001）。阳性对照组（地屈孕酮组）平均流产率为31.38%,较模型对照组下降18.77%;减味寿胎丸低剂量组平均流产率为36.70%,较模型组对照下降13.45%;减味寿胎丸高剂量组平均流产率为34.26%,较模型组对照下降15.89%;川续断皂苷Ⅵ低剂量组平均流产率为31.30%,较模型组对照下降18.85%;川续断皂苷Ⅵ高剂量组平均流产率为28.18%,较模型组对照下降21.97%;两两比较,差异均具有统计学意义（P<0.05）。3.孕鼠体重变化记录显示,各组孕鼠在妊娠期间的体重增长趋势基本一致。在GDO、GD3、GD6、GD9、GD12、GD14六个时间点中,各组大鼠的体重相比,差异无统计学意义（P>0.05）。提示了减味寿胎丸、地屈孕酮、续断皂苷Ⅵ干预对流产模型孕鼠体重无影响4.孕鼠胚胎直径的测量结果显示,米非司酮对孕鼠胚胎的发育没有抑制作用,而地屈孕酮、高低剂量减味寿胎丸和高低剂量川续断皂苷Ⅵ对孕鼠胚胎直径有促进增长的趋势,但是增长程度不明显,差异没有统计学意义（P>0.05）5.体视镜下见阴性对照组胚胎形态圆润饱满状,血供丰富,而模型组则相对干瘪,表面血瘀较明显,地屈孕酮、减味寿胎丸、川续断皂苷Ⅵ均能不同程度地改善模型孕鼠胚胎的瘀血情况。6.利用RT-PCR检测各组孕鼠子宫胚胎结合位点组织中ATG16L1、ATG9B mRNA的表达,结果显示,与阴性对照组相比较,模型组子宫胚胎结合位点组织中的ATG16L1、ATG9B mRNA均明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比,地屈孕酮、减味寿胎丸、川续断皂苷Ⅵ均能降低模型孕鼠子宫胚胎结合位点ATG9B以及ATG16L1的表达,差异有统计学意义（P<0.05）。7.利用免疫组化技术检测孕鼠子宫胚胎结合位点组织中ATG9B、ATG16L1、LC3Ⅱ的表达,结果提示,与对照组作比较,模型组中的ATG9B、ATG16L1、LC3Ⅱ的表达升高,而与模型组相比,减味寿胎丸以及其有效成分川续断皂苷Ⅵ能够降低ATG9B、ATG16L1、LC3Ⅱ的表达。8.Western Blotting结果显示,与阴性组相比较,模型组子宫胚胎结合位点组织中的ATG9B、ATG16L1表达升高,差异具有统计学意义（P<0.001）,而经过地屈孕酮、减味寿胎丸、川续断皂苷Ⅵ等药物干预后,结合位点中的ATG9B、ATG16L1表达下降（P<0.01）,说明了这些药物都能下调流产孕鼠结合位点中的ATG9B、ATG16L1蛋白的表达。p62作为自噬标志蛋白之一,在模型组大鼠子宫胚胎结合位点组织中表达下调（P<0.001）,而与模型组比较,高剂量减味寿胎丸、川续断皂苷Ⅵ能明显升高了 p62蛋白的表达（P<0.001）。五、减味寿胎丸对米非司酮诱导HTR8/Svneo细胞损伤模型自噬功能的研究1.CCK8结果显示,与Control组相比,米非司酮（MIF）组（浓度为50 μM）的细胞存活率明显下降（P<0.001）,细胞增殖减缓。自噬激活剂RAPA组（浓度为0.5 μ M）、自噬抑制剂组CQ（20 μM）与Control组相比较,差异没有统计学意义（P>0.05）。与MIF组相比,MIF+CQ组以及MIF+RAPA组细胞存活率亦无明显变化（P>0.05）。MIF+P50组（孕酮浓度为50 μM）、MIF+P100组（孕酮浓度为100 μ M）、MIF+ASA Ⅵ 50组（川续断皂苷Ⅵ浓度为50 μM）、MIF+ASA Ⅵ100组（川续断皂苷Ⅵ浓度为100 μM）、MIF+JW（减味寿胎丸浓度为0.1 mg/ml）均能够明显抑制米非司酮引起的细胞死亡（P<0.001）,促进细胞增殖。提示了孕酮、川续断皂苷Ⅵ以及减味寿胎丸能够拮抗米非司酮引起的细胞损伤,促进细胞增殖。2.米非司酮下调miR-198在滋养细胞中的表达,而减味寿胎丸及川续断皂苷Ⅵ能够促进miR-198在米非司酮损伤细胞模型中的表达。3.miR-198能够通过靶向结合ATG9B、ATG16L1调控细胞自噬活性。4.miR-198与ATG9B以及miR-198与ATG16L1之间均存在靶向结合的关系。结论:1.在自然流产绒毛组织与蜕膜组织中的miRNA表达谱会发生改变,而这些差异表达的miRNA可能是防治自然流产的潜在靶点,也可能是补肾安胎复方的有效作用靶点,应当深入挖掘,探讨其可能的作用机制。在本次研究中,对照正常早孕人工流产组织,自然流产绒毛组织有35个差异表达miRNA,而自然流产蜕膜组织有193个差异表达miRNA,这些差异表达miRNA及其靶基因可能是自然流产发生发展的关键分子,其中可能的机制之一是通过调控Hippo信号通路干预了滋养细胞以及蜕膜细胞的增殖与凋亡的动态平衡,从而导致了自然流产的发生发展。2.本研究通过对自然流产绒毛组织与蜕膜组织进行转录组高通量测序,发现了大量的差异表达基因,在自然流产组绒毛组织中发现过表达基因937个,低表达基因659个,合计1596个差异表达基因。自然流产蜕膜组织与正常早孕人工流产蜕膜组织相比较,发现3015个过表达基因,2186个低表达基因,合计5201个差异表达基因。这也间接提示了自然流产的发病机制非常复杂。本研究对在自然流产绒毛组织与蜕膜组织中均存在的差异表达基因进行了生物信息学分析,结果显示这些差异表达基因主要与免疫炎症的关系非常密切,调控了免疫炎症相关的信号通路,提示了我们要重视免疫因素在自然流产中的作用,这些基因及其相关的通路可能是防治自然流产的潜在靶点,也是药物开发的潜在靶点。3.在自然流产绒毛组织中,LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高,p62表达降低,提示了自然流产的发生可能与绒毛组织自噬活性增强有关。此外,本研究也鉴定了自然流产绒毛组织中miR-198表达降低,ATG9B、ATG16L1表达升高。4.减味寿胎丸以及川续断皂苷Ⅵ能够有效降低流产大鼠模型的流产率。流产孕鼠子宫胚胎结合位点组织中自噬活性存在着异常活化,而减味寿胎丸以及川续断皂苷Ⅵ降低的流产组织ATG16L1、ATG9B表达,抑制自噬活性过度增强。5.米非司酮能够下调miRNA-198在滋养细胞中的表达,从而激活了其下游靶基因ATG9B、ATG16L1表达,而减味寿胎丸及其有效成分川续断皂苷Ⅵ能够调控miR-198表达,进而抑制ATG9B、ATG16L1过表达而起到调控细胞自噬功能的作用,为补肾安胎的科学理论提供了新的科学内涵。6.本研究验证了 miR-198与ATG9B、ATG16L1之间存在靶向结合调控的关系。这种靶向调控关系的失衡可能导致了母胎界面细胞的过度自噬,从而引起了流产。