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本文对杆状病毒基因靶向传输系统和新型NO荧光探针的设计和应用进行了研究。研究工作分为两个部分。
第一部分设计合成了一种基于杆状病毒和壳聚糖的基因靶向纳米传输系统。通过化学交联的方法合成了壳聚糖修饰的杆状病毒,并通过zeta-电位,粒径测定,电镜测定和氨基含量测定对修饰后病毒进行了表征。以β-gal和eGFP两种质粒进行质粒转染实验后发现,修饰后病毒能够以较高的效率把质粒DNA传输至肝来源的细胞(HepG2),对非肝来源的细胞(Hela)而言,质粒DNA的输送效率很低。以流式细胞测定对质粒DNA的传输效率进行了测定,发现修饰后病毒在HepG2细胞中的基因传输效率是Lipofectamine的80%左右,而在Hela细胞中却极低。以秋水仙素处理HepG2后,修饰后病毒对质粒DNA的传输效率升高,说明修饰后病毒在进入细胞后并不能自身进入核膜进行复制。我们设计出了一种能够靶向于肝细胞的,安全高效的基因传输系统。同时,在本部分,我们利用蒙特卡罗模拟软件Mcell对电转染介导的基因传输过程中质粒DNA的扩散,降解和进核行为进行了理论计算研究,我们的计算结果表明,在电转染的过程中,质粒DNA通过扩散的方式进入细胞质,而在细胞质中,溶酶体的酸性核酸酶是决定质粒DNA半衰期的关键酶。
第二部分是关于一氧化氮(NO)检测荧光探针的开发和应用。一氧化氮是一种参与多种生物学功能的小分子自由基,它在炎症,心血管系统疾病,神经系统疾病和癌症的发生发展中都起着重要的作用。为了对它的生物学功能进行研究,对NO进行生物荧光成像是一种很好的研究手段。目前已有的大部分NO荧光探针测定的是NO的氧化产物,不能够对NO进行即时直接的荧光成像,Lippard等人设计的基于荧光素的铜配合物虽然能够即时测定细胞内的NO生成,但由于稳定性的原因,不能应用于生物体内的NO测定。以新的合成方法在常温下以高产率设计合成了一系列基于2-(2-羟基苯基)苯并咪唑和2-(2-羟基苯基)萘并咪唑的荧光化合物,它们能够和二价铜离子形成稳定的配合物,并且用于NO的荧光测定。我们确定了这些配合物的结构和稳定性,并通过荧光光谱,紫外-可见光谱,MALDI-TOF-MS质谱,红外光谱等测定,我们确定了这些铜配合物跟NO反应时,二价铜离子作为氧化中心,把NO氧化成NO+,进而进攻配体生成新的强荧光化合物。因此它们在有氧或无氧的条件下均能够测定NO的产生。这些配合物跟NO的反应具有高度的选择性,不受其他常见干扰分子的影响,并且有着合适的NO检测下限。我们把这些配合物应用于LPS激活的鼠巨噬细胞中NO产生的测定,得到了荧光在时间和空间上的较好分辨率。进而,我们把这些铜配合物应用于LPS和氨基半乳糖诱导的小鼠急性肝损伤中,获得了很理想的炎症中NO变化的荧光成像结果。所有的结果都一致显示这些苯并咪唑衍生物和铜形成的配合物能够作为一种很有希望的用于细胞或体内NO含量变化检测的荧光探针。