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研究目的:生物活性肽具有毒副作用小的作用特点,作为免疫调节剂在临床联合化疗药物减毒增效方面取得了一定成果而引起关注。然而,缺乏实验性依据限制了此类活性肽的应用。因此,在本课题中我们采用临床常用肿瘤化疗药物环磷酰胺(CTX)建立小鼠免疫抑制模型,研究小牛脾脏活性多肽和二肽对小鼠的免疫调节活性,旨在为脾脏活性肽的临床应用和开发提供有益的理论和实验依据。实验方法:(1)脾多肽注射液(Lienal Polypeptides Injection,LPI)对小鼠CTX免疫抑制的改善作用研究。将雄性C57BL/6小鼠随机分为正常对照组、CTX组、CTX联合LPI低及高剂量组(8和16 mg/kg,ip.)组、CTX联合胸腺五肽(TP5,2 mg/kg,ip.)组。小鼠连续7天进行LPI和TP5腹腔注射给药,第7天给予CTX(200 mg/kg,ip.),第8天乙醚麻醉后取脾脏、胸腺、腹腔液分别测定免疫器官指数、脾脏淋巴细胞数和脾脏淋巴细胞亚群数。(2)LPI对Lewis肺癌(LLC)荷瘤小鼠CTX免疫抑制的改善作用及协同抗肿瘤作用研究。取对数生长期的LLC细胞接种于C57BL/6小鼠腋下,肿瘤接种后第6天,将小鼠随机分为荷瘤对照组、CTX组(20 mg/kg,ip.)、CTX联合LPI低及高剂量组(8和16 mg/kg,ip.)、CTX联合TP5组(2 mg/kg,ip.)、LPI低及高剂量组(8和16 mg/kg,ip.)和TP5组(2 mg/kg,ip.)。连续腹腔给药15天,每隔两天记录小鼠肿瘤体积变化。第20天,所有小鼠乙醚麻醉,取脾脏、胸腺、腹腔液以及肿瘤,分别测定瘤重、免疫器官指数、脾脏淋巴细胞数、脾脏淋巴细胞亚群以及腹腔巨噬细胞吞噬功能。此外,采用生物信息学对LPI进行成分及功能分析。(3)脾脏活性二肽肌肽(Carnosine)对CTX免疫抑制的改善作用与机制研究。将雄性Kunming小鼠分为正常组、CTX组(20 mg/kg,iv.)、CTX联合Carnosine低及高剂量组(100和200 mg/kg,ip.)、CTX联合NAC组(200 mg/kg,ip.)。小鼠给药24 h后分离骨髓细胞检测活性氧ROS和DNA氧化损伤产物8-羟基脱氧鸟苷(8-oxo-d G)的水平,并检测骨髓细胞染色体、细胞周期以及细胞凋亡的变化。实验结果:(1)脾脏生物活性多肽LPI能够显著改善CTX对C57BL/6小鼠的免疫器官指数和脾脏淋巴细胞数目的抑制作用,并明显增加脾脏中CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞数。(2)在LLC荷瘤小鼠模型中,LPI能明显缓解CTX对免疫器官指数和脾脏淋巴细胞数目的抑制作用,增加脾脏CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞数,并且能显著地促进荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。同时,与CTX组相比,CTX及LPI联合给药组的肿瘤体积及重量明显减小,提示LPI能协同增加CTX的抗肿瘤作用。生物信息学分析结果也表明LPI能够影响机体免疫功能,对巨噬细胞吞噬功能相关信号通路的影响尤为明显。(3)脾脏生物活性二肽Carnosine能显著减少小鼠骨髓免疫祖细胞中CTX诱导的ROS和8-oxo-d G的水平,降低姐妹染色单体交换频率。同时,Carnosine能显著缓解CTX诱导的小鼠骨髓免疫祖细胞G2/M期细胞周期阻滞,显著降低p-Chk1/Chk1、p-p53/p53比率,下调p21蛋白表达。同时,Carnosine能显著减少小鼠骨髓免疫祖细胞中CTX诱导的细胞凋亡比率,下调Bax和细胞色素c(Cytc)蛋白表达,降低Cleaved-Caspase 3/Caspase 3比率。研究结论:脾脏活性多肽和二肽均能明显改善CTX的免疫抑制作用。其中,LPI能有效抑制CTX降低正常小鼠与LLC荷瘤小鼠外周成熟免疫细胞的数目,并能稳定T淋巴细胞亚群和提高巨噬细胞吞噬功能。通过以上免疫调节作用,LPI能协同增强CTX的抗肿瘤作用。Carnosine能显著抑制CTX诱导的骨髓免疫祖细胞的染色体异常、周期阻滞和细胞凋亡,其作用机制可能与Carnosine抑制骨髓细胞DNA氧化损伤有关。