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研究目的:创伤性颅脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)以其高致死致残率成为世界范围内重要公共卫生问题。创伤后原发性血脑屏障破坏导致脑血流灌注不足、血脑屏障通透性升高,代谢失衡、出凝血障碍等病理过程,引起继发性脑损伤,加重血脑屏障开放,形成恶性循环。及时修复血脑屏障成为TBI治疗的关注重点之一。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)又被称作血管通透性因子,在血脑屏障开放、血管新生中起到重要作用。血管内皮生长抑制因子(Vascular endothelial growth inhibitor,VEGI)是机体内天然抑制VEGF的因子,且在抑制VEGF的同时并不影响血管内皮细胞的正常功能。因此,本实验在建立TBI动物模型的基础上,检测TBI后不同时间点VEGF和VEGI的表达变化,探讨二者与血脑屏障通透性的相关联系。通过侧脑室注射VEGI纯化蛋白对TBI急性期小鼠进行干预治疗,观察TBI后VEGF表达变化,血脑屏障通透性的改变,创伤侧细胞凋亡水平和小鼠神经运动功能。同时,探究VEGI对VEGF的下游作用机制,及其在TBI急性期抑制血管新生的作用机制。研究方法:1)在C57BL/6雄性小鼠上建立TBI模型,应用Western Blot技术检测TBI后不同时间点创伤侧纤维蛋白原的含量。2)应用Western Blot技术分别检测TBI后不同时间点VEGF和VEGI的各自表达量。3)应用立体定位侧脑室微量注射技术,对TBI后小鼠进行VEGI干预。4)通过改良的神经功能缺损评分(modified Neurological Severity Score,mNSS)和错步实验对实验各组进行神经功能评分。筛选出差异最大时间点,进行后续探究。5)应用Western Blot和免疫荧光技术检测比较TBI第3天对照组和干预组血脑屏障通透性的变化。6)应用Western Blot技术检测VEGFR2和下游eNOS的磷酸化表达。7)应用流式细胞技术和AnnexinV/PI试剂盒检测比较创伤对照组和VEGI干预组小鼠创伤侧细胞凋亡情况。8)应用Western Blot、免疫荧光技术观察血管新生相关细胞的变化。9)体外实验中比较VEGI对内皮细胞和周细胞成管能力的影响。10)应用Western Blot技术检测血管新生相关因子的相对表达变化。结果:1.TBI后小鼠血脑屏障开放在第3天最为显著。VEGF在TBI后逐渐升高,第3天达峰值。VEGI在TBI后第3天下降明显。综合比较VEGF与VEGI比值发现,VEGF/VEGI值在TBI后逐渐升高,在第3天最为明显。2.VEGI干预后对TBI小鼠神经运动功能改善从第3天开始出现明显差异。VEGI干预明显减少创伤侧的细胞凋亡数量,减轻了血脑屏障开放程度。VEGI干预可以显著抑制TBI急性期创伤侧VEGFR2和其下游eNOS的磷酸化。3.VEGI干预显著抑制了TBI后的血管新生,体现在对血管新生相关细胞的抑制和对血管新生相关因子之间平衡的调节。结论:1.TBI急性期后VEGF的单一变化不能完全解释血脑屏障通透性升高的时间峰值,综合VEGF与VEGI相对变化可能会更有效的研究TBI后血脑屏障损伤的原因。TBI急性期第3天VEGF相对于VEGI的高表达可能为血脑屏障通透性峰值的原因之一,为后续TBI急性期的治疗奠定基础。2.VEGI局部干预在TBI急性期对神经功能的改善作用集中于TBI后第3天,我们选用创伤后第3天为后续实验的重要观察点。3.VEGI通过减少紧密连接蛋白的损伤,降低基质金属蛋白酶的表达,抑制VEGF-VEGFR-2下游的磷酸化,有效地降低了血脑屏障通透性。VEGI局部干预在TBI后第3天有效抑制创伤侧的细胞凋亡。4.VEGI干预一定程度上恢复了TBI后促血管新生相关因子和抑制血管新生因子表达的失衡,减少了未成熟的新生血管的形成,以阻止血脑屏障通透性进一步的升高,从而缓解TBI后的继发性损伤。