研究背景:肺癌是世界最常见的恶性肿瘤之一,临床诊断发现时肺癌往往已发生远处转移。近年来,越来越多的研究开始关注肿瘤微环境在肺癌中的作用。2002年美国生物学家Shreigber提出肿瘤免疫编辑(tumor immunoediting)学说,该理论认为肿瘤发展包括3个阶段,即清除(elimination)、平衡(equilibrium)及逃逸(escape)。随着免疫编辑的进展,肿瘤细胞不断增值、恶化,同时伴随抗肿瘤免疫的失势,以及局部组织结构的破坏。而局部组织结构的破坏(包括局域细胞因子及趋化因子分泌模式的改变)又影响淋巴细胞的局部招募及功能表型,从而加速了免疫失势,进而促进肿瘤恶化,如此形成恶性循环。组织基质细胞是最早感知免疫编辑的细胞群体,其如何通过细胞因子及趋化因子影响免疫失势研究较少,是我们关注的焦点。IL-17家族是感知粘膜组织破坏最为敏感的危险感受器(danger sensor),其家族成员中,关于IL-17D的研究很少,有研究指出其主要表达于肺脏、骨骼肌,我们前期的研究发现IL-17D主要由CD45-细胞表达。在此基础上,了解IL-17D在肺脏组织中的具体来源细胞,阐明其在肺癌局域微环境中的作用。并探讨NK细胞、CD8+T细胞肺脏迁移模式、表型特征和功能变化规律,认识IL-17D缺失影响NK细胞肺脏迁移、表型和功能的调节机制。研究目的:1.我们前期的研究发现肺脏中IL-17D主要由CD45-细胞表达。在此基础上,在小鼠肺脏肿瘤生长过程中,针对肺脏几种基质细胞,探讨肺脏IL-17D的主要细胞来源和表达变化趋势。2.明确NK、CD8+T细胞肺脏迁移模式、表型特征和功能变化规律,认识IL-17D缺失影响NK细胞肺脏迁移、表型和功能的调节机制。研究方法:1.建立B16转移性肺癌、皮肤癌、小肠癌小鼠模型;采用滴鼻吸入IL-17D制剂的方式给予小鼠外源性补充IL-17D。2.实时定量荧光PCR技术检测小鼠肺脏、皮肤、小肠组织的IL-17D表达;q-PCR技术检测小鼠肺脏趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11、S1Pr5及细胞因子S1Pr1、IL-12、IL-15、GM-CSF、IL-22、IL-23、IL-1β、TNF-a的m RNA表达。3.流式细胞胞内外因子双染法检测小鼠肺脏成纤维细胞的IL-17D分泌水平;流式细胞术检测小鼠肺脏CD4+T、CD8+T、NK细胞比例及其分泌IFN-γ水平。4.采用胶原酶消化法及组织块贴壁法分离培养原代小鼠肺成纤维细胞及人胚胎肺成纤维细胞,并采用差时贴壁法进行纯化,采用流式细胞术检测表面标志进行鉴定。5.肿瘤细胞与肺成纤维细胞不同比例共培养,肿瘤培养上清与肺成纤维细胞不同浓度共培养,RT-PCR技术检测肺成纤维细胞IL-17D、CXCL9、CXCL10的m RNA表达。6.为进一步验证IL-17D对肺脏成纤维细胞局域招募NK及CD8+T细胞的影响及机制,将肺成纤维细胞种于下室,采用肺癌细胞LLC细胞上清及IL-17D对肺成纤维细胞进行刺激,并将其与外周血、肺脏、脾脏中的淋巴细胞采用Transwell共培养,采用流式细胞术检测进入下室的淋巴细胞中NK及CD8+T细胞的比例。RT-PCR技术检测下室肺成纤维细胞IL-17D、CXCL10、IL-15的m RNA表达。研究结果:1.IL-17D在肿瘤组织中表达下降。q-PCR及流式细胞术的结果显示,在肺脏中,IL-17D主要由CD45-细胞表达;IL-17D在B16转移性肺癌、皮肤癌、肠癌组织中的蛋白及m RNA表达均显著下降(P<0.05),在肺癌组织中的降低尤为明显。另外,在B16转移性肺癌组织中,IL-17D的m RNA表达水平随时间呈递减趋势。2.肺脏中IL-17D的细胞来源。流式细胞术结果显示,肺脏中CD45-IL-17D+的细胞中有40~80%是成纤维细胞(CD45-CD140a+)。另外,流式细胞胞内外因子双染法表明,肺脏成纤维细胞分泌的IL-17D在小鼠B16转移性肺癌中显著减少(P<0.05)。3.B16转移性肺癌局域浸润淋巴细胞的表达模式。流式结果显示,B16转移性肺癌局部浸润的CD3+T、CD8+T及NK细胞比例均显著降低(P<0.05),CD4+T无明显变化;另外,NK细胞分泌的IFN-γ明显减少(P<0.05),而CD4+T、CD8+T细胞分泌IFN-γ无显著变化。4.B16转移性肺癌局域趋化因子及细胞因子分泌模式。肺脏成纤维细胞可分泌CXCL9、CXCL10、GM-CSF、IL-1β、TNFa和IL-23等多种因子,不但可以募集多种淋巴细胞的局部聚集,也影响原位淋巴细胞的表型和功能。q-PCR结果显示,与正常对照小鼠相比,B16转移性肺癌小鼠肺脏CXCL9、CXCL10的m RNA表达水平显著下降(P<0.05);S1Pr1、IL-12、IL-15、GM-CSF的m RNA表达均明显下调(P<0.05)。5.IL-17D抑制小鼠肿瘤肺转移。与PBS对照组相比,IL-17D滴鼻小鼠的肺脏肿瘤克隆数显著下降(P<0.05),并且伴随肺脏局部浸润CD8+T及NK细胞比例显著增加(P<0.05);另外,q-PCR结果显示,IL-17D滴鼻小鼠的肺脏CXCL9、CXCL10、GM-CSF的m RNA表达水平明显上升(P<0.05),表明IL-17D可能是通过CXCL9、CXCL10趋化NK、CD8+T细胞至肿瘤局部,发挥抗肿瘤作用。6.肿瘤细胞抑制原代肺成纤维细胞IL-17D表达。B16肿瘤细胞与小鼠肺成纤维细胞共培养后收集细胞做RT-PCR,结果显示,B16细胞可明显抑制成纤维细胞IL-17D及趋化因子CXCL9、CXCL10的m RNA表达,且抑制效果与共培养比例呈正相关。另外人肺癌A549细胞培养上清可显著抑制原代人胚胎肺成纤维细胞的增殖及IL-17D及CXCL9、CXCL10的m RNA表达,且抑制效果呈浓度依赖性。7.IL-17D对肺成纤维细胞体外趋化NK及CD8+T细胞的影响。流式细胞术显示,与对照组(下层不接种细胞)相比,肺成纤维细胞可有效趋化肺脏、外周血及脾脏NK及CD8+T细胞进入下室。经LLC上清刺激培养后,肺成纤维细胞对NK及CD8+T细胞的趋化作用显著减弱(P<0.05),若同时加入r m IL-17D刺激,则肺成纤维细胞对NK及CD8+T细胞的趋化作用明显增加(P<0.05),且与r m IL-17D剂量成正相关。另外,通过收集下室肺成纤维细胞做RT-PCR,结果显示,经LLC上清刺激后,肺成纤维细胞IL-17D、CXCL10及IL-15的m RNA表达水平显著下调,若同时加入r m IL-17D刺激,则肺成纤维细胞IL-17D、CXCL10及IL-15的m RNA表达水平明显上调。结论:1.肺脏成纤维细胞分泌的IL-17D在抗肿瘤免疫中发挥重要作用:肺癌中成纤维细胞分泌IL-17D减少可引起趋化因子CXCL9、CXCL10及细胞因子IL-12、IL-15、GM-CSF表达降低,进而导致肿瘤局域募集的NK、CD8+T细胞数量减少、功能减弱,从而促进肿瘤肺转移。2.成纤维细胞分泌的IL-17D通过CXCL9、CXCL10趋化NK细胞及CD8+T细胞至肿瘤局部,发挥抗肿瘤作用。研究背景:根据联合国原子辐射影响问题科学委员会近期发表的一份报告指出,在全世界人口遭受的由自然或人为因素导致的各种辐射中,有接近20%来自医疗辐射。辐射(irradiation,IR)对放疗病人及从业人员的损伤已引起社会广泛关注,其通过产生反应氧和自由基,可造成机体活细胞尤其是免疫细胞形态与功能的损伤。临床肿瘤放疗产生的副作用,在免疫系统可表现为具有免疫抑制作用或促肿瘤作用的一些细胞亚群如Treg、Th17、MDSC等的累积。T细胞是高度异质性的细胞群体。其中,CD4+初始T细胞在不同细胞因子微环境下,可以向不同细胞亚群如Th1、Th2、Th17及Treg等分化,从而介导不同免疫功能。这些细胞亚群之间相互促进、相互抑制,共同打造机体有效的抗肿瘤免疫微环境,因此,辐射损伤后T细胞亚群的免疫重建能力直接关系到机体的抗肿瘤作用。肉桂(cinnamon)具有滋养肝肾的作用,其作为香料和调味品在全世界范围内得到广泛应用。作为组方药,肉桂常用于治疗糖尿病、关节炎、肿瘤等,而其在辐射后靶向T细胞的作用尚不明确。研究目的:1.观察小剂量全身辐射损伤后小鼠T细胞亚群免疫重建的特点,为临床如何利用机体自身的免疫修复能力科学选择肿瘤放疗频率和时间提供实验依据。2.辐射损伤后免疫重建受损会削弱机体的抗肿瘤免疫,本研究探讨辐射后机体免疫重建受损对肿瘤转移的影响及肉桂的调节作用,为临床肿瘤放疗病人药物辅助治疗提供基础研究数据。研究方法:1.肉桂水提液的制备:采用传统法水煎、醇沉、回收乙醇,制备成肉桂水提液。2.辐射损伤模型及肉桂制剂的干预方法:采用X射线2.5 Gy单次全身照射建立小鼠辐射损伤模型;在小鼠于饮用水中给予0.1%水提液建立肉桂处理模型。3.肿瘤模型的建立:采用B16细胞2×105个尾静脉注射,建立转移性肺癌模型。4.采用血细胞分析仪检测小鼠血常规变化。5.流式细胞术检测小鼠外周血、脾脏中CD3+T、CD4+T、CD8+T变化以及脾脏中CD80、CD86、MHC-I、MHC-II的表达水平。6.胞内外染色法分析小鼠脾脏及肺脏中CD4+T细胞各亚群Th1(CD3+CD4+IFN-γ+)、Tc1(CD3+CD8+IFN-γ+)、Th2(CD3+CD4+IL-4+)、Th17(CD3+CD4+IL-17A+)、Treg(CD4+CD25+foxp3+)及IFN-γ+IL-17A+Th17细胞的比例变化。7.逆转录PCR技术检测小鼠脾脏中CD4+T细胞各亚群特征性核转录因子T-bet、GATA3、RORγT、Foxp3的m RNA水平的变化;RT-PCR技术检测IL-12、IL-15、IL-23的m RNA水平变化。8.利用解剖显微镜观察辐射前后及肉桂处理前后小鼠肺部肿瘤转移克隆数变化。研究结果:1.淋巴细胞是应对辐射最敏感的细胞群体。在血常规的几项指标中,淋巴细胞比例在辐射后第3、5天显著下降(P<0.05),在辐射后第5天开始恢复,在10天较第3天显著增加(P<0.05),开始恢复。单核细胞、粒细胞、红细胞、血红蛋白无显著变化。2.辐射损伤后T细胞亚群变化特点。脾脏和外周血中的CD3+T细胞在淋巴细胞中的比例在第3、5天显著降低(P<0.05),在第10天开始恢复。CD3+T细胞的绝对数也发生同步改变。CD4+T细胞比例在第5天降到最低,在第8天开始恢复。CD8+T细胞比例和绝对数在第3天降至最低,在第5天已开始恢复,CD4+T细胞的免疫重建较CD8+T细胞延迟。另外,共刺激分子CD80、CD86及MHC-II水平及IL-12、IL-15、IL-23的m RNA表达在辐射后第5天显著降低(P<0.05),在辐射后第10天明显增加(P<0.05)。3.辐射损伤后CD4+T细胞各亚群变化特点。通过检测脾脏中Tc1、Th1、Th2、Th17、Treg在T细胞中所占比例,进一步观察了CD4+T细胞细胞因子分泌模式,结果显示,在辐射后第10天,伴随着CD4+T细胞总体水平的恢复,CD4+T细胞各亚群仍处于失衡状态,表现为:与对照组相比,Tc1、Th1亚群比例和绝对数显著下降(P<0.05),Th2、Th17、Treg亚群比例则明显增加(P<0.05)。具有抗肿瘤作用的IFNγ+IL-17A+Th17亚群比例显著降低(P<0.05)。4.肉桂调节辐射损伤后T细胞亚群免疫重建作用。与辐射模型组相比,肉桂处理小鼠的Th1、Tc1亚群比例及细胞数显著上升(P<0.05),Th17亚群比例明显降低(P<0.05),Treg细胞比例及绝对数均显著下降(P<0.05),Th2亚群无明显变化。IFNγ+IL-17A+Th17亚群比例明显增加(P<0.05)。5.CD4+T细胞各亚群的特征性核转录因子变化。与对照组相比,照射后第10天小鼠T-bet的m RNA表达水平显著下调(P<0.05),GATA3、RORγT、Foxp3的m RNA表达水平则明显上调(P<0.05);与照射小鼠相比,肉桂处理小鼠T-bet的m RNA表达水平显著增高(P<0.05),Foxp3的m RNA表达水平则明显降低(P<0.05),GATA3则无显著变化。这些变化与CD4+T细胞各亚群变化一致。6.肉桂加强了辐射损伤小鼠对抗肿瘤转移的作用。与B16小鼠相比,辐射后B16小鼠肺部的肿瘤克隆数显著增加(P<0.05);与辐射后B16小鼠相比,肉桂处理的辐射后B16小鼠肺部肿瘤克隆数明显降低(P<0.05)。7.辐射损伤前后肺部肿瘤局域T细胞亚群变化特征。与正常B16小鼠相比,辐射损伤后B16小鼠肺脏肿瘤浸润Th1、Tc1比例显著降低(P<0.05),肉桂处理后,Th1、Tc1比例显著增加(P<0.05),这些变化也与肿瘤发展一致。结论:1.T淋巴细胞在辐射后第3-5天降至最低,在第10天恢复至正常水平,其中CD4+T细胞免疫重建较CD8+T细胞延迟。2.小剂量全身辐射损伤后T细胞亚群免疫重建特点表现为Th1的劣势,及Th17、Treg的相对优势,这种状态促进了肿瘤转移。肉桂通过促进Th1亚群增殖,抑制Th17及Treg亚群,从而有效逆转辐射损伤后T细胞亚群失衡,从而加强抗肿瘤免疫。