研究背景：在人类肿瘤中,肿瘤侵袭性和转移性潜力与高端粒酶的表达密切相关。端粒酶逆转录酶(hTERT)可以通过诱导端粒酶的活化增强端粒的稳定性,从而导致细胞的恶变。以往的研究表明,端粒酶可以促进胃癌、肝癌以及食道癌的侵袭和转移。作为肿瘤侵袭、转移的基本前提,上皮间质转化(EMT)在肿瘤的侵袭、转移过程中起着非常关键的作用。在多种肿瘤当中hTERT可以通过Wnt信号促进EMT的发生,但是hTERT是否可以通过其它途径促进肿瘤EMT的发生,至今没有相关报道。在本研究中我们发现在结肠癌细胞中,hTERT可以和锌指E-box结合同源盒1(ZEBl)形成复合物直接绑定到E-钙黏蛋白(E-cadherin)的启动子,从而抑制E-cadherin的表达并促进EMT的发生。在HCT116和SW480细胞中过表达hTERT可以抑制E-cadherin的表达,但是干扰了ZEB1后即使过表达了hTERT基因,E-cadherin的表达仍然可以恢复。总之,我们的研究结果表明hTERT可以通过在ZEBl途径促进EMT的发生,以hTERT. ZEB1为靶点的治疗可以为预防、治疗肿瘤的转移提供新的途径。研究方法：第一部分：人端粒酶逆转录酶通过非Wnnt信号通路促进结肠癌上皮间叶转化的机制研究1、采用Real-time PCR.免疫荧光及Western-blot技术检测结肠癌细胞过表达hTERT的情况,以及过表达hTERT后结肠癌细胞的形态及E-cadherin、N-cadherin等相关标志物的变化,以检测hTERT对结肠癌细胞EMT的影响;2、采用双荧光素酶实验检测在结肠癌细胞中hTERT的过表达对E-cadherin启动子的影响；3、Top-Fop实验检测在SW480、HCT116过表达hTERT及加入Wnt抑制剂XAV后Wnt信号通路的活性,同时Western-blot及免疫荧光检测E-cadherin的变化。以检测hTERT及XAV对SW480、HCT116细胞Wnt信号通路的影响；4、双荧光素酶实验检测hTERT、XAV对SW480、HCT116细胞E-cadherin启动子活性的影响；5、Western-bolt技术分别在SW480、HCT116细胞中检测hTERT对β-catenin入核情况的影响,用来检测hTERT是否会通过促进β-catenin进入细胞核而影响Wnt信号通路的活性。第二部分：人端粒酶逆转录酶通过ZEBl促进结肠癌上皮间叶转化的分子机制研究l、免疫共沉淀技术和激光共聚焦技术检测hTERT、ZEB1的结合及在细胞中的定位,证实hTERT/ZEB1蛋白复合体的存在；2、通过染色质免疫共沉淀技术检测hTERT与E-cadherin启动子结合情况及结合位点；3、通过Western-bolt技术及免疫荧光技术检测过表达hTERT同时干扰掉ZEBl后E-cadherin、N-cadherin等蛋白的表达,以证实hTERT是否会通过ZEBl促进结肠癌细胞EMT的发生；4、通过染色质免疫共沉淀技术检测hTERT是否是通过ZEBl与E-cadherin启动子结合。5、划痕实验、Transwell及裸鼠尾静脉注射实验证实从体内、体外两方面证实hTERT是否可以通过ZEBl促进结肠癌细胞的侵袭转移。研究结果：第一部分：人端粒酶逆转录酶通过非Wnnt信号通路促进结肠癌上皮间叶转化的研究1、在SW480和HCTll6细胞中hTERT可以促进细胞形态学上发生上皮间叶的改变；2、Western blot和免疫荧光实验结果表明hTERT可以显著降低E-cadherin蛋白的表达,而N-cadherin和Vimentin的表达显著升高；3、qPCR分析发现过表达hTERT后间质标志物Snai1在SW480细胞中表达升高,而HCTll6细胞并没有变化；4、双荧光素酶实验证实了在SW480、HCT116结肠癌细胞中hTERT可以抑制E-cadherin启动子的活性；5、Top-Fop实验发现在SW480细胞中hTERT可以活化Wnt信号通路,但是在HCTll6细胞中Wnt信号通路的活性并没有改变；6、我们用Wnt信号通路抑制剂XAV处理SW480和HCTll6细胞,发现XAV可以抑制SW480细胞的Wnt信号通路活性,E-cadherin蛋白表达也有所恢复,而HCTll6细胞的Wnt信号通路活性及E-cadherin的表达并无改变；7、我们在SW480和HCTl 16细胞中抑制了Wnt信号通路的关键因子β-catenin,结果同样显示SW480细胞的Wnt信号通路被抑制,E-cadherin表达升高,HCTll6细胞Wnt信号通路及E-cadherin没有改变；8、Western blot检测SW480、HCT116细胞过表达hTERT后β-catenin的入核情况,发现hTERT可以促进SW480细胞的β-catenin进入细胞核,而HCTll6细胞核的β-catenin没有改变；9、我们在SW480和HCTll6细胞中抑制Wnt信号通路后,双荧光素酶实验发现在SW480细胞中E-cadherin启动子活性可以恢复,而HCTll6细胞E-cadherin的启动子活性无变化。第二部分：人端粒酶逆转录酶通过ZEB1促进结肠癌上皮间叶转化的分子机制研究1、免疫共沉淀证实了在HCT116细胞中hTERT可以与ZEBl相互作用。结果显示我们在hTERT中可以拉出ZEBl,同样的在ZEBl中我们也可以拉出hTERT。激光共聚显微镜也观察到了hTERT和ZEBl在HCTll6细胞中的共定位；2、针对ZEBl与E-cadherin启动子E-box区域的结合位点我们设计了3条引物,染色质免疫共沉淀实验发现hTERT可以和E-cadhernin启动子-1959bp to-1954bp区域结合；3、免疫印迹和免疫荧光实验发现当我们干扰了ZEBl后同时过表达hTERT后EMT发生了逆转。过表达hTERT后E-cadherin表达下降,N-cadherin和Vimentin表达上调。但是干扰掉ZEBl后E-cadherin恢复性调高,N-cadherin和Vimentin表达下调：4、双荧光素酶报告系统发现在HCTll6细胞中过表达hTERT后再干扰ZEB1, E-caderin启动子活性有所回复；5、染色免疫共沉淀实验分析发现过表达hTERT后,hTERT与E-cadherin启动子的结合增加,但是当我们干扰了ZEBl后hTERT与E-cadherin的启动子结合降低；6、免疫印迹检测到到在SW480细胞里过表达hTERT后ZEBl的表达上调,但是在HCT116细胞里并没有发现ZEB1的变化；7、Transwell穿膜和划痕实验发现在HCT116细胞中过表达hTERT后细胞的迁移能力明显提高p<0.01),但是干扰了ZEBl后细胞的迁移能力显著下调。裸鼠尾静脉注射实验发现过表达hTERT可以促进肿瘤细胞的肺转移,但是干扰了ZEBl后肿瘤细胞的肺转移明显下调。研究结论：1、本研究首次证实了hTERT可以通过EMT促进结肠癌的转移。我们也发现了hTERT通过新的路径促进肿瘤EMT的发生。在这个研究中我们发现hTERT可以抑制E-cadherin的表达,同时又促进了N-cadherin和Vimentin的表达。进一步深入研究发现hTERT可以抑制E-cadherin启动子的活性来诱导EMT的发生,而在HCTll6细胞中这条通路是独立于Wnt信号通路的,尽管在其它肿瘤中hTERT是通过Wnt这条经典信号通路来促进EMT的发生的。这个结果为hTERT促进肿瘤转移的机制补充了新的理论；2、在这个研究的基础上我们发现了hTERT可以通过EMT促进结肠癌细胞的转移。其机制就是hTERT可以与ZEBl相互作用形成一个蛋白复合体,然后与E-cadherin的启动子结合抑带E-cadherin的表达,从而促进EMT的发生。综上所述我们首次证明了hTERT/ZEB1蛋白复合体的存在并结合E-cadherin的启动子直接靶向调控E-cadherin,从而通过调节EMT相关因子以促进肿瘤的侵袭、转移。我们的发现为hTERT促进结肠癌的EMT发生提供了新的观点,还可能为以hTERT作为为靶点的抗结肠癌治疗提供新的治疗方法。