目的人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)侵犯CD4+T细胞,使机体获得性免疫功能严重受损,最终可导致各种机会性感染或肿瘤。CD8+T细胞是介导细胞免疫的效应T细胞,经抗原致敏后可以特异性杀伤携带致敏抗原的靶细胞,如肿瘤细胞、病原微生物感染的细胞等。T细胞通过其表面的受体和CD4或CD8分子同抗原提呈细胞提呈的MHC-肽复合物结合从而传导活化信号,进而对靶细胞发挥杀伤功能。有研究表明CD8+T细胞也可表达一些抑制性或活化性的NK相关受体(NK associated receptors, NKR)当它们识别其相应的配体后,产生抑制或活化信号,进而决定CD8+T细胞是否杀伤病原微生物感染的细胞或肿瘤细胞。CD8+T细胞根据NK相关受体基因定位的不同可表达的受体类型有：C型凝集素超家族受体(CD94/NKG2受体)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immno-globulin-like receptor, KIR)。C型凝集素超家族中CD94/NKG2A为抑制性受体,NKG2A与CD94形成异二聚体,可以识别HLA-E,从而传导抑制信号,可抑制CD8+T细胞对靶细胞的杀伤；NKG2D是一个重要的活化性受体,像其他NKG2类家族的成员一样是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白,包含C型植物凝集素样NK受体区域,CD8+T细胞NKG2D的功能是作为一个共刺激受体,NKG2D识别其相应的配体传导活化信号,可活化CD8+T细胞发挥对靶细胞的杀伤功能。免疫球蛋白样超家族抑制性受体KIR3DL1抑制了CD8+T细胞溶解靶细胞的活性。据文献报道CD8+T细胞表面表达的NK相关受体可调控CD8+T细胞杀伤靶细胞的功能,是功能性受体标志着T细胞发挥抗病毒抗肿瘤的能力。但迄今为止,尚无针对HIV原发感染期(Primary HIV-1infection, PHI)CD8+T细胞表面NK相关受体表达及对HIV抑制作用的相关研究,由于原发感染期患者获得非常困难,故以往研究都是针对HIV慢性感染者。我们首次对原发感染患者CD8+T细胞表面活化性和抑制性的NK相关受体表达进行研究。以往国际上对于CD8+T细胞表面NK相关受体的研究多是单一的受体,而我们首次将活化性和抑制性受体进行组合搭配研究,使不同细胞群功能研究的更为细致。方法一、研究对象本研究对象为103例成人,其中未接受高效抗逆转录病毒治疗的61例HIV感染者,接受高效抗逆转录病毒治疗的20例HIV感染者,与HIV感染者年龄相匹配的男性健康对照22例,上述HIV感染者均来自男男性接触(Men who have sex with men, MSM)队列。未接受抗病毒治疗的HIV感染者年龄分布为21-54岁(29.8±7.6),可分为HIV原发感染者29例即PHI组(感染时间为6个月以内)、慢性HIV感染者19例即HIV组(CD4+T细胞介于200-500个／μl之间,无艾滋病指征性疾病)和艾滋病患者13例即AIDS组(CD4+T细胞<200个／μl或出现艾滋病指征性疾病)。接受抗病毒治疗的HIV感染者20例即HAART组(经过严格的至少一年的高效抗逆转录病毒治疗后,病毒RNA<400copies/ml,200个/μl≤CD4+ T淋巴细胞<500个／μl),年龄分布为22-45岁(30.5±7.8)。健康对照组为22例随机抽取的HIV抗体阴性、未暴露于HIV的健康人,年龄分布为24-60岁(29.46±7.48)。二、T细胞绝对值检测T细胞绝对值检测完全依照1997年美国CDC关于HIV感染者CD4+T细胞检测指导方法严格执行,使用BD公司TruCOUNT管,FACSCalibur流式细胞仪检测MULTISET软件分析结果。具体步骤如下：将20μl CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP试剂加入绝对计数管中,逆向加样法加入50μl EDTA抗凝血,室温避光15min,加入经10倍稀释BD公司的免洗溶血素450μl,室温避光15min,样本溶血彻底后FACSCalibur流式细胞仪检测,MULTISET软件进行分析,自动生成CD3+T/CD4+T/CD8+T淋巴细胞绝对值的结果。三、CD8+T细胞表面NK相关受体NKG2D、NKG2A、KIR3DL1表达的检测使用五色荧光标记的单克隆抗体组合CD3 PE-Cy7/CD8 Percp/NKG2D APC /NKG2A PE/CD38 FITC和CD3 PE-Cy7/CD8 Percp/NKG2D APC/KIR3DL1 PE/CD38 FITC对几组研究对象外周全血进行表面染色,即每个研究对象均有两个按上述不同组合染色的样本管,另设一管同型对照管。样本管内均加入100μl EDTA抗凝全血,按上述两种组合单抗分别加入样本管内,室温避光25min后加入自制溶血素3mL,室温避光8分钟充分溶血后,300g离心10min,弃上清。加入3mLPBS进行洗涤,室温,300g离心10min,弃上清,共洗涤两次。最终加入含有1%多聚甲醛的PBS200uL悬浮,BD FACSAria检测,DiVaTM软件进行分析。如下图：P1为淋巴细胞,以P1为门,定义CD3+淋巴细胞,再以P2为门,定义出CD3-CD8+(P3),然后再分析CD8+T细胞表面各NK相关受体表达的百分含量季吗,并且同时检测表面活化受体、抑制受体表达水平。四、HIV病毒载量测定以500μl血浆采用标准版模板制备法提取RNA,采用Roche公司HIV-1Monitor 1.5 commercial kit在COBAS AMPLICOR自动载量仪上以RT-PCR方法测定病毒载量。检测范围为400-750, 000copies/ml。五、统计学分析应用SPSS11.5软件包进行统计分析,全部数据表示用中位数±95%可信区间。各组间实验指标的比较采用Mann-Whitney U检验分析,相关性分析采用Spearman秩相关检验,P<0.05为有统计学意义。实验结果一、HIV原发感染不同时间CD8+T细胞表面NKR的表达及活化情况选取感染时间为3个月的原发感染患者19例,感染时间为6个月的原发感染患者10例,同时又选取22个年龄性别与原发感染患者年龄相匹配的健康对照。将3组进行比较,发现感染3个月的患者较健康对照组CD8+T细胞单独表达NKG2A+有升高的趋势,感染6个月的患者较感染3个月的患者单独表达NKG2A+有升高的趋势,但三组间并无显著性差异；感染3个月的患者较健康对照组CD8+T细胞单独表达KIR3DL1+显著下降,感染6个月的患者与健康对照相比单独表达KIR3DL1+显著下降,感染6个月的患者较感染3个月的患者单独表达KIR3DL1+有下降的趋势但并无显著性差异；上述三组间CD8+T细胞单独表达NKG2D+的水平也无显著性差异,对细胞群进一步细致划分；感染3个月的患者较健康对照表达NKG2D+NKG2A-的CD8+T细胞的百分比有下降的趋势但无统计学意义,感染6个月的患者与健康对照相比表达NKG2D+NKG2A-的CD8+T细胞的百分比显著下降,感染6个月的患者较感染3个月的患者表达NKG2D+NKG2A-勺百分比无显著性差异,说明在HIV原发感染期CD8+T细胞表面NKG2D+NKG2A-的表达就有逐渐下降的趋势。感染3个月的患者较健康对照表达NKG2A+NKG2D-的CD8+T细胞所占的百分比无明显变化,而感染6个月的患者与健康对照相比表达NKG2A+NKG2D-CD8+T细胞的百分比显著升高,感染6个月的患者与感染3个月的患者相比表达NKG2A+NKG2D-CD8+T细胞的百分比有升高的趋势但无显著性差异,说明在HIV原发感染期CD8+T细胞表面NKG2A+NKG2D-的表达就有逐渐升高的趋势。感染3个月的患者与健康对照相比CD8+T细胞表面CD38表达的百分含量显著增加。感染6个月的患者与健康对照相比CD8+T细胞表面CD38表达的百分含量显著增加,但感染6个月与感染3个月的患者相比CD8+T细胞CD38的表达虽有升高趋势但无统计学差异,说明在HIV原发感染期CD8+T细胞处于一种活化的状态,且在病毒的持续刺激下被活化的水平逐渐升高。二、CD8+T细胞表面NKR的表达和活化对病毒调定点的影响以及与VL的相关性(一)观察这两组HIV原发感染者CD8+T细胞表面NKR表达的情况及CD8+T细胞活化水平结果发现：NKG2D+NKG2A-CD8+T细胞其百分含量在低病毒调定点组显著高于高病毒调定点组；NKG2A+CD8+T细胞表达百分含量低病毒调定点组显著低于高病毒调定点组；NKG2A+NKG2D-CD8+T细胞百分含量在低病毒调定点组显著低于高病毒调定点组；NKG2D+NKG2A+CD8+T细胞百分含量低病毒调定点组显著低于高病毒调定点组；CD38+CD8+T细胞的多少直接反映CD8+T细胞活化水平的高低,其百分含量低病毒调定点组显著低于高病毒调定点组。(二)HIV原发感染者病毒复制水平与CD8+T细胞免疫指标的相关性1、CD8+T细胞表面表达NKG2D+NKG2A-的百分含量与1gVL呈负相关(R=-0.359 P<0.05)2、CD8+T细胞表面表达NKG2A+NKG2D-的百分含量与1gVL呈正相关(R=0.451 P<0.01)3、CD8+T细胞表面表达NKG2D+NKG2A+的百分含量与1gVL呈正相关(R=0.454 P<0.01)4、CD8+T细胞表面表达NKG2A+的百分含量与1gVL呈正相关(R=0.519 P<0.01)5、CD8+T细胞表面表达CD38+的百分含量与1gVL呈正相关(R=0.665 P<0.05)三、HIV原发感染者与慢性感染者相比较,外周血CD8+T细胞表面NKR的表达和活化情况及相关性的研究选取HIV原发感染者29例、与之年龄相匹配的HIV慢性感染者19例、进入AIDS期的患者13例、HAART组20例以及健康对照22例。(一)NKG2A+CD8+T细胞的表达水平分析CD8+T细胞表面NKG2A受体的表达情况,发现自HIV原发感染阶段开始并无显著变化,只有进入AIDS期后此群显著升高,经HAART治疗后又降至较健康人低的水平。其中AIDS组显著高于NC组(P<0.01 AIDS中位数=18.7,NC中位数=3),AIDS组显著高于PHI组(P<0.05 AIDS中位数=18.7,PHI中位数=3.4),AIDS组显著高于HIV组(P<0.01AIDS中位数=18.7,HIV中位数=3.5),AIDS组显著高于HAART组(P<0.05 AIDS中位数=18.7,HAART中位数=2.9)。(二)NKG2A+NKG2D-CD8+T细胞的表达水平发现自原发感染期NKG2A+NKG2D-CD8+T细胞的百分含量逐渐升高进入AIDS期后又进一步升高,经HAART治疗后又降至健康人的水平。其中AIDS组显著高于NC组(P=0.01 AIDS中位数=0.8,NC中位数=0.1),AIDS组显著高于PHI组(P<0.01AIDS中位数=0.8,PHI中位数=0.2)AIDS组显著高于HIV组(P<0.01AIDS中位数=0.8,HIV中位数=0.2),AIDS组也显著高于HAART组(P=0.001AIDS中位数=0.8,HAART中位数=0.2)。(三)NKG2D+CD8+T细胞的表达水平分析CD8+T细胞表面NKG2D受体的表达情况,发现HIV感染后此群细胞的百分含量变化不大。各组间无统计学差别(NC中位数=96.2,PHI中位数=96.3,HIV中位数=94.5,AIDS中位数=92.6,HAART中位数=97.0)。(四)NKG2D+NKG2A-CD8+T细胞的表达水平发现自原发感染期开始此群细胞百分含量逐渐减少,进入AIDS期显著下降,经HAART治疗后又升高至健康人的水平,其中AIDS组显著低于NC组(P<0.001AIDS中位数=67.8,NC中位数=93.2),AIDS组显著低于PHI组(P<0.05AIDS中位数=67.8,PHI中位数=87.8),AIDS组显著低于HIV组(P=0.001AIDS中位数=67.8,HIV中位数=88.3),AIDS组也显著低于HAART组(P<0.001AIDS中位数=67.8,HAART中位数=91.5)。(五)NKG2D+NKG2A+CD8+T细胞的表达水平可观察到此群细胞自HIV原发感染期并无显著变化,只有进入AIDS期后显著升高,经HAART治疗后可恢复至较健康人还低的水平。其中AIDS组显著高于NC组(P<0.01AIDS中位数=15.8,NC中位数=3.0),AIDS组显著高于PHI组(P<0.05AIDS中位数=15.8,PHI中位数=3.7),AIDS组显著高于HIV组有统计学意义(P<0.05 AIDS中位数=15.8,HIV中位数=3.4)。(六)CD8+T细胞活化标志物CD38的水平CD38表达的高低直接反映CD8+T细胞活化水平的高低。可观察到HIV感染后在原发感染期显著上升进入慢性感染期又下降,进入AIDS期又升高,经HAART后可下降但未降至健康人的水平。PHI组显著高于NC组(P<0.001.PHI中位数=53.0,NC中位数=12.0),HIV组显著高于NC组(P<0.01 HIV中位数=33.9,NC中位数=12.0),AIDS组显著高于NC组(P<0.001AIDS中位数=47.5,NC中位数=12.0),PHI组显著高于HIV组(P<0.05 PHI中位数=53.0,HIV中位数=33.9),PHI组显著高于HAART组(P<0.001 PHI中位数=53.0,HAART中位数=15.1),HIV组显著高于HAART组(P<0.05 HIV中位数=33.9,HAART中位数=15.1),AIDS组显著高于HAART组(P=0.001 AIDS中位数=47.5,HAART中位数=15.1)。(七)HIV感染者(原发感染者和慢性感染者)免疫学指标相关性分析1、CD8+T细胞表面NKG2D+NKG2A-表达的百分含量与CD4+T细胞的绝对数量呈正相关(R=0.316 P<0.05)；CD8+T细胞表面NKG2A+NKG2D-表达的百分含量与CD4+T细胞的绝对数量呈负相关(R=-0.357 P<0.05)。2.CD8+T细胞表面CD38表达的百分含量与1gVL呈正相关(R=0.690 P<0.01)见图9,C;CD8+T细胞表面CD38表达的百分含量与CD4+T细胞的绝对数量呈负相关(R=-0.320 P<0.05)。结论综上所述,CD8+T细胞在抗击病毒感染和肿瘤方面发挥重要的免疫监督作用。我们的研究发现HIV原发感染期开始CD8+T细胞表面NKR:NKG2A、NKG2D表达就发生改变。NKG2D+NKG2A-CD8+T百分含量随病毒载量升高而降低,CD8+T细胞NKG2D+NKG2A-表达的百分含量与CD4+T细胞的绝对数量呈正相关。NKG2A+NKG2D-CD8+T百分含量病毒载量升高而升高,CD8+T细胞NKG2A+NKG2D-表达的百分含量与CD4+T细胞的绝对数量呈负相关。可得出结论,HIV感染后随着疾病的进展NKG2D+NKG2A-CD8+T百分比降低,NKG2A+NKG2D-CD8+T百分比升高,CD8+T细胞对靶细胞的杀伤遭遇抑制,使CD8+T细胞杀伤功能减弱。