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一、研究背景：应激性胃溃疡(急性胃黏膜损伤)是临床上危重症患者常见并发症,尤其发生在严重烧创伤、重大手术、严重颅脑伤、严重感染等急危重人群。经过长期以来国内外学者的研究指出急性胃黏膜损伤主要与以下几方面相关：神经内分泌失调、胃酸分泌增多、PG及NO等保护性因子减少、活性氧生成增多、胃黏膜细胞增殖/凋亡失衡等。我们课题组长期致力于急性胃黏膜损伤及愈合的研究,前期通过制备浸水束缚应激模型(WIRS)模拟损伤性应激对大鼠胃黏膜损伤的发生、发展的影响及对其可能机制进行探讨,并从应激控制的层面,发现一些常用的麻醉药、镇静药,如舒芬太尼、氯胺酮、右美托嘧啶等的预处理都可以有效的保护AGML,那么在手术、麻醉过程中还存在一些非损伤性应激,如紧张、焦虑、恐惧等一系列心理应激,这些会不会对急性胃黏膜损伤造成影响?其应激机制又是如何?心理应激(psychological stress)是有认知、评价能力的个体在察觉应激源威胁时,所引发的一种身心紧张状态,持续的这种机体紧张状态在心脑血管疾病、神经内分泌疾病、免疫系统疾病中起重要作用。动物心理应激模型包括水浸、束缚制动、噪声、电击等,但其中一些存在物理性应激成分,而束缚应激作为一种非损伤性刺激,能够较好地模拟人类生活中“无法控制”的拥挤、挫折等生活状态,因此,束缚应激是一种良好的心理应激模型。本课题主要通过束缚应激来制备心理应激模型,观察其对急性胃黏膜损伤及其愈及可能机制,为确定心理应激导致胃黏膜损伤提供可靠的依据,同时从束缚应激导致胃黏膜损伤的可能原因入手,探讨相应的干预措施及治疗手段；进一步为临床防治应激性胃黏膜损伤提供学术观点,旨在降低重大手术、严重创伤包括重症颅脑损伤后及严重感染等重症患者AGML的发生率和减轻其损伤程度。二、研究目的：通过对大鼠复制慢性束缚应激及浸水束缚应激模型,并对造成胃黏膜损伤的可能原因如胃酸、氧自由基损伤、细胞增殖与凋亡失衡等进行分析,故本课题的实验目的主要有：1.通过观察不同时间束缚应激对正常大鼠胃黏膜的作用,探索出心理应激对胃黏膜的影响及可能的影响因素；2.通过观察慢性束缚预处理对于WIRS对大鼠胃黏膜损伤的作用,模拟术前的心理应激对于术中应激导致胃黏膜损伤的影响,进一步分析其影响因素；3.通过观察束缚应激对WIRS致胃黏膜损伤后愈合的作用,探讨心理应激对于术后患者胃黏膜修复的影响及可能原因。三、实验方法：(1)32只成年雄性SPF级Wistar大鼠,随机分为4组,分别为：正常组(NC组)、束缚应激3d组(RS3组)、束缚应激5d组(RS5组)和束缚应激7d组(RS7组),除NC组外,均制备束缚应激模型,每天记录4组大鼠的体重。实验内容包括：1造模后水合氯醛麻醉大鼠,测定胃液PH,计数溃疡指数(UI)。2采用HE染色方法观察胃黏膜损伤情况；3刮取胃黏膜液氮冻存,分别提取组织总蛋白和总RNA,采用Western-Blot及实时荧光定量PCR检测胃黏膜中PCNA、Caspase-3的蛋白及mRNA的表达变化；4各组大鼠麻醉后取其腹主动脉血,离心并留取血清,以检测各组大鼠血清中SOD、MDA含量；(2)32只成年雄性SPF级Wistar大鼠,随机分为4组,分别为：正常组(NC组)、浸水束缚应激组(WIRS组)、慢性束缚应激组(RS组)和慢性束缚应激后浸水束缚应激组(RS+WIRS组),后两组均制备束缚应激7天模型,WIRS及RS+WIRS组均制备浸水束缚应激模型。实验内容同第一部分。(3)64只成年雄性SPF级Wistar大鼠,随机分为8组,分别为：正常组(NC组)、浸水束缚应激组(WIRS组)、浸水束缚应激后3d(F3组)、5d(F5组)、7d组(F7组)、浸水束缚应激后慢性束缚应激3d(S3组)、5d(S5组)、7d组(S7组),除NC组外,均制备浸水束缚应激模型,RS组均制备束缚应激模型。实验内容同第一部分。四、实验结果：(1)NC组大鼠均未见胃黏膜损伤性改变,镜下细胞排列完整,腺体结构正常；束缚组随应激时间延长,大鼠胃黏膜可见明显充血、水肿,呈深红色及点状或线状出血、坏死,镜下细胞肿胀、充血,排列紊乱,腺体结构不完整。束缚应激后大鼠胃黏膜损伤的溃疡指数及组织含水量显著升高(P<0.05),且与束缚时间呈正比。与NC组相比,RS组大鼠胃液PH值均升高(P<0.05),且随着束缚时间延长,PH逐渐升高(P<0.05)。与NC组相比,RS组大鼠的血清SOD呈先升高后降低,RS三组血清MDA均升高(P<0.01),且三组均下调了SOD/MDA(P<0.01)。RS3组的PCNA表达较正常对照组明显降低(P<0.01),caspase-3的表达明显增多(P<0.01)；RS5组的PCNA表达逐渐减少至最低,caspase-3的表达逐渐增多；RS7组的PCNA及Caspase-3的表达均达最高峰。(2)NC组大鼠均未见胃黏膜损伤性改变,镜下细胞结构完整,排列整齐,腺体结构正常；WIRS组胃腔内有大量棕色血性液体,黏膜糜烂、出血、坏死,镜下细胞及腺体结构消失；RS组大鼠胃黏膜呈深红色,可见明显充血、水肿及点状出血,镜下细胞排列疏松；RS+WIRS组大鼠胃腔内咖啡色液体及坏死粘膜较WIRS组少,但线状出血明显增多,且深达肌层,镜下粘膜连续性中断。与NC组相比,余三组的溃疡指数及组织含水量都有升高(P<0.05),特别是WIRS组和RS+WIRS组(P<0.01)；与WIRS组相比,RS+WIRS组的UI及组织含水量更高(P<0.05)。与NC组相比,RS组胃液PH升高(P<0.05),余两组显著降低(P<0.01)；与WIRS组相比,RS+WIRS组胃液PH更高(P<0.05)。与NC组相比,余三组的SOD及MDA均升高明显(P<0.01),且WIRS组最高,而SOD/MDA均下降(P<0.01),以WIRS组最低；与WIRS组相比,RS+WIRS组血清SOD及MDA均更低(P<0.01),而SOD/MDA则无统计学意义(P>0.05)；Q-PCR/Western-Blot及免疫组化的结果一致显示：与NC组相比,WIRS组及RS+WIRS组的PCNA表达相对减少(P<0.01),而RS组表达则明显增多；与WIRS组相比,RS+WIRS组PCNA表达略多(P>0.05)。与NC组相比,余三组胃黏膜Caspase-3的表达均显著增多(P<0.01),且与WIRS组相比,RS+WIRS组胃黏膜Caspase-3的表达明显增多(P<0.05)。(3)NC组大鼠均未见胃黏膜损伤性改变,胃腔见少量棕灰色食物残渣,胃液呈透明淡黄色,黏膜光滑、颜色红润；WIRS组胃腔内有大量棕色血性液体,黏膜糜烂、出血、坏死,镜下细胞及腺体结构消失,粘膜下血管和皮区血管充血；随着时间延长,溃疡指数减小,组织水肿减轻,胃溃疡逐渐愈合,到第7天基本恢复正常；在溃疡愈合过程中,束缚3天组溃疡愈合比非束缚3天组好,且差异有统计学意义(P<0.05),束缚5天组与非束缚5天组愈合差异不明显,束缚7天组则明显慢于非束缚7天组(P<0.05)；与NC组相比,WIRS组胃液PH降低(P<0.01),在愈合过程中,胃液PH值逐渐升高,但差异不明显,同时间段束缚组胃液PH均高于非束缚组(P<0.05)；浸水束缚应激后,血清SOD及MDA均升高,而SOD/MDA则明显下降；在溃疡愈合过程中,SOD、MDA均逐渐降低,SOD/MDA逐渐恢复正常；其中,同时间段束缚组MDA高于非束缚组,且随着束缚时间延长,MDA逐渐升高；与NC组相比,WIRS组胃黏膜PCNA表达明显减少(P<0.05),在愈合过程中,各组胃黏膜PCNA表达均增多(P<0.01),其中S3组最多；与NC组相比,余各组胃黏膜Caspase-3表达均增多,特别是WIRS组表达最多；与WIRS组相比。愈合各组胃黏膜Caspase-3的表达相对减少,与非束缚组相比,同时间段的束缚组大鼠胃黏膜PCNA表达减少(除外3d组)、Caspase-3表达相对增多(P<0.05)；五、实验结论：(1)慢性束缚应激会引起胃黏膜损伤,且损伤程度与束缚时间呈正比,这不仅与下调胃黏膜SOD/MDA有关,还与慢性束缚应激导致胃黏膜细胞凋亡明显增加、增殖能力下降相关,这是溃疡发生的重要原因；(2)慢性束缚应激预处理会加重WIRS致急性胃黏膜的损伤,这可能主要与慢性束缚应激导致的胃黏膜上皮细胞大量凋亡有关。(3)大鼠经浸水束缚应激致胃黏膜损伤后大约经7天胃黏膜结构可基本恢复正常,而胃黏膜功能恢复可能还需更长时间：慢性束缚应激早期可以加速胃黏膜损伤的愈合,但随着束缚时间延长,则会延缓损伤的愈合,这可能与应激早期可以促进胃黏膜上皮细胞增殖,而随着应激强度增加,胃黏膜上皮细胞增殖减少、凋亡增多,导致愈合延迟。