背景&目的紫杉醇(paclitaxel,PTX)是从太平洋紫衫的树皮中提取出来的一种天然四环二萜类抗肿瘤药,紫杉醇对多种实体瘤具有抗肿瘤活性,包括卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌。这种天然化合物由于缺少离子化基团表现出较差的水溶性(<1μg/mL)。紫杉醇具有较低的口服生物利用度(<2%),因而在临床上常用静脉注射给药。导致其口服生物利用度低的原因一是较差的水溶性(<1μg/mL);二是作为P-糖蛋白(P-gp)的底物受到P-gp外排作用而导致肠道低透过性以及肠道中P450酶如CYP3A4对紫杉醇的代谢作用,降低紫杉醇体内血药浓度,进而导致生物利用度较低。目前常用的紫杉醇注射剂(商品名为Taxol(?))是由聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇以50:50(v/v)的比例混合溶解。由于聚氧乙烯蓖麻油会引起严重的过敏反应、肾毒性、神经毒性以及心脏毒性等不良反应,故很大程度上限制了紫杉醇的应用。对此,研究者采用脂质体和白蛋白作为紫杉醇的载体,成功开发了新的紫杉醇注射剂,大大改善了原有剂型的局限性。但是,就口服和注射比较,由于口服给药的顺应性较好,所以,开展紫杉醇口服药剂的研究仍然是发展紫杉醇新的给药剂型的重点方向之一。至今,研究者提出了各种不同制剂策略来解决上述紫杉醇的问题。例如通过微乳药物传递系统、普朗尼克/肝素-全反式维甲酸混合聚合紫杉醇胶束、紫杉醇的纳米海绵和纳米乳药物传递系统等,试图提高紫杉醇的口服生物利用度。然而,是至今没有成功上市的口服紫杉醇制剂用于抗肿瘤的治疗,同时是在已有的各种研究报告中,用于构建制剂的载体存在稳定性和生物相容性等问题,特别是对人体的安全性还需进一步验证,而且验证安全性会需要大量时间和成本。于是,本研究中选用了一种常用药物甘草酸(Glycyrrhizic acid,GA),利用其本身具有的两亲性特点来作为一种载体,构建新型的紫杉醇给药制剂。由于甘草酸的功能性(如具有抑制P-gp功能作用),以及在临床使用中的安全性,因此,开发以甘草酸作为紫杉醇给药体系的载体,利于研究成果向实际应用的转化。甘草酸为三萜类皂苷,报道可作为口服吸收促进剂,不仅能有效地增加疏水性药物的溶解度,而且能增加疏水性药物的细胞膜透过性(约60%)和降低细胞膜的弹性系数。甘草酸作为一种表面活性剂,其聚集体或者胶束能与疏水性药物形成“主-客”体的包合复合物,能有效地增加药物的溶解度和避免药物沉淀析出。有趣的是,紫杉醇和甘草酸都属于萜类化合物,同时紫杉醇与甘草酸具有相似的相对分子质量。根据相似相溶的原理,甘草酸有可能与紫杉醇互溶,从而增加紫杉醇溶解度。再者,甘草酸与其主要代谢产物甘草次酸一样能抑制P-gp的功能。除此之外,还有报道表明甘草酸对大鼠肝微粒体中CYP3A、CYP1A1和CYP2E1同样有抑制作用。基于以上分析,甘草酸所具有的功能性,安全性和载体特点,本文拟构建一种甘草酸-紫杉醇给药体系,并对这种给药体系的口服生物利用度进行评价。虽然甘草酸作为药物的增溶剂已有许多的研究报告,但是,以甘草酸作为载体,从生物药剂学角度评价对药物生物利用的调控作用,本文尚是先例。通过本文的研究,我们希望能获得一种对紫杉醇的生物利用度具有较明显增加作用的甘草酸直接作为其载体的给药体系。内容&结果:第一部分:进行PTX-loadedGAmicelles(紫杉醇-甘草酸纳米胶束)处方前研究,包括建立PTX的高效液相色谱法(HPLC)定量方法、确定包封率(encapsulation efficiency,EE)和载药量(drug loading rate,DL)测定方法以及研究甘草酸对紫杉醇的溶解度影响。结果:在优化的乙醇浓度(7.5%)和甘草酸浓度(10mM)条件下,紫杉醇溶解度达到823.38± 14.41μg/mL,这是紫杉醇水中溶解度的1000倍(0.67→823μg/mL)同时是7.5%乙醇条件时紫杉醇溶解度增加约100倍(8.51→823μg/mL)。第二部分:通过以粒径、多分散系数、zeta电位、包封率和载药量为评价指标进行单因素考察,确定制剂处方;再通过正交设计优化处方和制备工艺。在最优化条件下所制备PTX-loaded GAmicelles(n=3)的平均粒径为245.6±11.53nm,其多分散系数为0.192±0.02,其zeta电位为-45.7±1.8 mV,其包封率为90.22±0.11%,其载药量为7.90±0.04%。第三部分:对PTX-loaded GA micelles进行表征,主要从形态学、稳定性、示差扫描量热法和体外释放这几方面对PTX-loaded GA micelles的理化性质进行系统考察。结果表明,PTX-loaded GA micelles外观为乳白色液体且流动性好。透射电镜的观察结果表明所有胶束均以球状胶束的形式存在,分散性好。同时对PTX-loaded GA micelles的冻干粉末进行扫描电镜观察,可观察到在甘草酸的包裹作用下形成了一些带有颗粒表面的球状纳米胶束。将PTX-loaded GA micelles置于4℃冰箱放置3个月,考察其粒径以及包封率的变化。从存储稳定性考察结果可以看出,PTX-loaded GA micelles在4℃条件下,放置3个月,其粒径和包封率变化不大,表明其在此条件下稳定。对紫杉醇标准品粉末、空白甘草酸胶束粉末、紫杉醇与空白甘草酸胶束粉末的物理混合物以及PTX-loaded GA micelles的冻干粉末进行示差扫描量热法的研究,结果表明了紫杉醇被甘草酸胶束包裹,并以无定型的状态存在于胶束中。采用动态透析法,以加入1%(v/v)吐温80的人工胃液和人工肠液为释放介质,在37℃条件下对PTX-loaded GA micelles的体外释放特征进行考察。PTX-loaded GA micelles在人工胃液的最初2小时中紫杉醇释放小于30%,而在整个人工胃液/人工肠液系统中紫杉醇释放达到70-75%,然而Taxol(?)在整个人工胃液/人工肠液系统中几乎完全释放。结果表明,PTX-loaded GA micelles与Taxol(?)相比,呈现出缓释特点。在本实验中,以一级动力学函数对PTX-loaded GA micelles(R2 = 0.995)以及Taxol(?)(R2 = 0.997)的体外释放行为拟合度最高,所以一级动力学函数为最佳模型。第四部分:本文考察分别口服给药(20mg/kg)的PTX-loaded GA micelles和Taxol(?)后药物代谢动力学变化。PTX-loaded GA micelles组的紫杉醇的峰浓度(Cmax)(0.460±0.10μg/mL)显著高于同剂量的Taxol(?)组的紫杉醇的峰浓度(0.095±0.01μg/mL)(p<0.05)。PTX-loaded GA micelles组血药浓度-时间曲线下面积(AUC0→24h)高于Taxol(?)组的血药浓度-时间曲线下面积约6倍(p<0.05)。PTX-loaded GA micelles组与Taxol(?)组的达峰时间(tmax)无统计学差异。(p>0.05)本实验表明,PTX-loaded GAmicelles组与Taxol(?)组相比,提高了紫杉醇口服生物利用度约6倍,而且不改变紫杉醇血药浓度达峰时间。第五部分:本文采用在体肠封闭法对PTX-loaded GAmicelle以及Taxol(?)经不同肠道吸收的血药浓度进行研究,计算紫杉醇药动学参数,从而推测紫杉醇的吸收情况。当比较PTX-loaded GA micelle以及Taxol(?)在同一肠道的吸收情况时,我们发现PTX-loaded GA micelle在空肠和结肠给药组中紫杉醇的血药浓度-时间曲线下面积(AUC)显著高于Taxol(?)组的AUC(p<0.05)。当比较不同肠道之间的吸收情况时,PTX-loaded GAmicelle组的结果表明紫杉醇经不同肠段吸收的AUC存在显著性差异(P<0.05),进一步多重比较结果显示,PTX-loaded GA micelle在三个肠段的吸收之间显著性差异,空肠>结肠>回肠,表明空肠为最佳吸收部位。讨论&结论:立足于PTX水溶性差,其辅助溶媒容易引起严重不良反应等问题,本文首次以GA作为载体对紫杉醇进行包封,并加入乙醇作为稳定剂,最终制备出稳定的纳米级制剂,增加紫杉醇溶解度,进而改善口服利用度。以甘草酸作为药物的直接载体构建药物(包括本文中紫杉醇)给药体系尚未有相关报道。目前在构建一些给药体系中许多材料仍需较长时间来验证其临床使用的安全性,然而甘草酸目前已经在临床上使用多年,故具有安全性的保障,因此甘草酸直接作为药物的载体显示了其具有“潜在成药性”载体的特点。在紫杉醇溶解度研究中首次发现乙醇的浓度能影响甘草酸胶束的稳定性,进而有效增加或减少甘草酸对紫杉醇的增溶作用。通过不同比例乙醇的研究,发现乙醇浓度对增溶作用的影响存在一个最佳比例。当乙醇浓度在7.5%左右时,甘草酸之间形成的氢键能起到稳定甘草酸胶束的作用,有效增加了甘草酸对紫杉醇增溶作用。同时本文发现并不是乙醇比例越高越有利于胶束形成,当乙醇量高于15%,乙醇将破坏胶束的氢键稳定结构,进而降低了甘草酸对紫杉醇的增溶作用。经过实验的摸索和探究,最终确定最佳乙醇浓度为7.5%,在该比例下,甘草酸能形成稳定的PTX-loadedGA micelles。另外,溶解度实验中也表明甘草酸对紫杉醇的增溶作用存在浓度依赖性,但甘草酸浓度若高于20mM将形成胶状,故最终选择10mM为最终浓度。乙醇和甘草酸协同有效提高紫杉醇溶解度达到823.38±14.41μg/mL,提高紫杉醇水中溶解度近1000倍(0.67→823μg/mL),同时是7.5%乙醇条件时紫杉醇溶解度增加约100倍(8.51→823μg/mL)。乙醇和甘草酸协同增加紫杉醇溶解度同样未见报道。本文研究表明:空白GA micelles的Zeta电位为-1.1mV,PTX-loaded GA micelles的Zeta电位为-45.7mV,进行药物包裹后,胶束的Zeta电位绝对值非常显著地提高,达到45.7。一般来说,Zeta电位绝对值越大,证明所得胶束之间的静电力较大,不利于相互聚集,从而增加了胶束的稳定性。考察PTX-loaded GA micelles置于4℃冰箱放置3个月的稳定性时,同时对制剂的Zeta电位进行检测。结果表明,三个月内Zeta电位变化不大,因而制剂所呈现的稳定性很大程度归功于胶束之间较大的静电力。示差扫描量热法结果显示,PTX-loaded GA micelles的冻干粉末与紫杉醇与空白甘草酸胶束粉末的物理混合物不同,并未出现两个吸热峰,并且仅显示出与甘草酸空白胶束冻干粉末相同的吸热峰,表明紫杉醇被甘草酸胶束包裹,并以无定型的状态存在于胶束中。体外释放结果表明,PTX-loaded GA micelles与Taxol(?)相比,呈现出缓释特点。而在PTX-loaded GA micelles整个体外释放过程中紫杉醇释放达到70-75%,然而Taxol(?)几乎完全释放。PTX-loaded GA micelles不能完全释放的可能原因是由于透析过程乙醇作为小分子先被透析到接受液,进而甘草酸胶束稳定结构被破坏,可能发生聚集和沉降不利于紫杉醇的释放并透过透析袋,同时紫杉醇水中溶解度较低更依赖于甘草酸胶束中的非极性环境,因而导致不能完全释放。在药代动力学的研究中,PTX-loaded GA micelles与Taxol(?)相比,能显著提高紫杉醇的口服生物利用度近6倍。PTX-loaded GA micelles能增加紫杉醇的吸收,这可能是甘草酸在以下方面的综合作用,包括对紫杉醇溶解度的增加、形成纳米药物传递系统、对P-gp外排泵的抑制作用以及对CYP3A酶的代谢抑制作用。通过在体肠封闭法进一步研究表明,PTX-loaded GA micelles存在肠道吸收区段差异,其中空肠吸收最好。当比较PTX-loaded GA micelle以及Taxol(?)在同一肠道的吸收情况时,PTX-loaded GA micelles在空肠和结肠段的吸收均高于Taxol(?)在空肠和结肠段的吸收情况。进一步表明,PTX-loaded GA micelles吸收的增加很大程度上是由于紫杉醇在空肠以及结肠上吸收的增加引起。甘草酸具有促进紫杉醇在空肠和结肠中吸收的作用并最终提高生物利用度也为本文首次发现和报道。