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目的:利用新生期三氟乙醚持续惊厥结合青霉素二次打击模型探讨瘦素对惊厥急性期蛋白水平(或含量)及远期神经行为、惊厥阈和苔藓纤维异常发芽的影响。方法:日龄6天(P6)的Sprague-Dawley(SD)大鼠60只,参照随机数字表法进行随机分组,共四组,分别是:第一组为单纯对照组(Control组,n=15),第二组是瘦素对照组(Leptin组,n=15),第三组是惊厥组(SE组,n=15),最后一组是惊厥+瘦素组(SE+Leptin组,n=15)。分组完成后适应性喂养1天,SE组和SE+Leptin组大鼠用三氟乙醚诱导持续(30min)惊厥发作,每日一次,连续7天(P7-P13),建立新生期大鼠反复持续惊厥模型(SE)。对Control组和Leptin组进行同样操作但不吸入三氟乙醚。Leptin组及SE+Leptin组大鼠每日持续惊厥后1小时向腹腔按照4mg/kg的剂量注射瘦素(溶于PBS缓冲液),同时Control组和SE组向腹腔注射同等剂量PBS缓冲液。在急性期(末次惊厥后24小时),每组随机抽取5只,麻醉后心脏采血,然后取脑组织,采用酶联免疫吸附试验(Elisa)测血清中clusterin和VEGF的含量,采用免疫印迹检测大鼠皮层和海马中蛋白的相对水平:自噬通路相关蛋白Beclin-1、LC3 II/LC3 I,内质网应激相关蛋白GPR78、ATF4,抗凋亡蛋白Bcl-2和NLRP3炎症体。余40只大鼠,每隔3天检测大鼠体重变化,于P23和P33进行神经行为学测试(负向趋地反射、旷场实验及新物体识别实验);P28-P33进行Morris水迷宫实验,P34天腹腔注射青霉素二次打击测惊厥阈(出现惊厥发作的时间)和存活率,然后在每组存活大鼠中随机取5只,灌流取脑,用Neo-Timm法观察大鼠海马齿状回和CA3区苔藓纤维异常发芽情况。结果:1.Westem bolt结果:四组大鼠的大脑皮层和海马中蛋白水平均有显著性差异[Beclin-1:F皮层(3,16)=9.81,P<0.05,F(3,16)=9.87,P<0.05;LC3 II/LC3 I:F 皮层:(3,16)=96.62,P<0.05,F海马(3,16)=161.30,P<0.05;GRP78:F(3,16)=8.16,P<0.05,F(3,16)=7.60,P<0.05;ATF-4:F(3,16)=14.20,P<0.05,F 海马(3,16)=19.54,P<0.05;Bcl-2:F 皮层(3,16)=13.96,P<0.05,F 海马(3,16)=20.43,P<0.05;NLRP3:F 皮层(3,16)=21.08,P<0.05,F 海马(3,16)=16.99,P<0.05],与Control组相比,SE组大鼠大脑皮层和海马中Beclin-1、LC3 II/LC3 I、GRP78、ATF-4、NLRP3的蛋白水平明显升高(P<0.05),Bcl-2的蛋白水平明显降低(P<0.05),与SE组相比,SE+Leptin组大鼠大脑皮层和海马中Beclin-1、LC3 II/LC3 I、GRP78、ATF-4、NLRP3 的蛋白水平明显减少(P<0.05),Bcl-2 的蛋白水平明显升高(P<0.05)。2.ELISA结果:四组大鼠的血清中clusterin和VEGF含量有显著性差异[clusterin:F(3,16)=14.24,P<0.05;VEGF:F(3,16)=18.69,P<0.05],SE 组血清中的clusterin和VEGF含量较Control组明显升高(P<0.05),瘦素干预降低了 SE后的血清中clusterin含量(P<0.05),而进一步升高SE后的血清中VEGF含量(P<0.05)。3.体重变化:四组大鼠体重组间有显著性差异[F(3,27)=85.79,P<0.05],记录天数间有显著性差异[F(7,63)=1160.48,P<0.05]、组间因素与记录天数交互作用有显著性差异[F(21,189)=9.05,P<0.05]。P11-P34,SE 组和 SE+Leptin 组大鼠体重较Control组明显降低(P<0.05),瘦素干预对Control组和SE组体重无影响。4.负向趋地实验:四组大鼠P23、P33时的负向趋地时间有显著性差异[F P23(3,36)=21.25,P<0.05;F P33(3,36)=33.68,P<0.05]。SE 组大鼠的负向趋地时间较Control组延长(P<0.05),瘦素干预降低了 SE后的负向趋地时间(P<0.05).5.旷场实验:(1)四组大鼠P23、P33时的延迟时间有显著性差异[F P23(3,36)=66.74,P<0.05;FP33(3,36)=106.40,P<0.05],SE 组大鼠的延迟时间较 Control组明显延长(P<0.05),瘦素干预降低了 SE后的延迟时间(P<0.05);(2)四组大鼠P23、P33 时的开场得分有显著性差异[F P23(3,36)=25.50,P<0.05;FP33(3,36)=32.60,P<0.05],SE组大鼠的开场得分较Control组明显降低P<0.05),瘦素干预升高了 SE后的开场得分(P<0.05)。6.新物体识别实验:四组大鼠P23、P33时的识别指数有显著性差异[F P23(3,36)=10.33,P<0.05;FP33(3,36)=23.99,P<0.05],SE 组大鼠的识别指数较 Control组明显降低(P<0.05),瘦素干预明显升高了 SE后的识别指数(P<0.05)。7.Morris水迷宫实验:(1)定位航行实验:四组大鼠逃避潜伏期组间有显著性差异[F(3,27)=47.02,P<0.05],训练天数间有显著性差异[F(4,36)=567.311,P<0.05],组间因素与天数交互作用有显著性差异[F(12,108)=3.432,P<0.05]。从P29到P32,SE组大鼠的逃避潜伏期较Control组明显延长P<0.05),瘦素干预明显缩短了 SE后的逃避潜伏期(P<0.05)(2)空间探索实验:四组大鼠P33时的穿越平台次数有显著性差异[F(3,36)=5.42,P<0.05]。SE组大鼠的穿越平台次数较Control组明显减少P<0.05),瘦素干预明显增多了 SE后的穿越平台次数(P<0.05)。8.二次打击后惊厥阈:(1)四组大鼠P34时的惊厥阈有显著性差异[F(3,36)=15.76,P<0.05]。SE组大鼠的惊厥阈较Control组明显降低(P<0.05),瘦素干预明显升高了 SE 后的惊厥阈(P<0.05)。(2)Control 组、Leptin 组、SE 组和 SE+Leptin组的存活率分别是90%,90%,50%,70%。9.Neo-Timm染色:四组大鼠P34时齿状回(DG区)和CA3区的苔藓纤维异常发芽评分有显著性差异[FDG(3,16)=25.73,P<0.05;FCA3(3,16)=20.33,P<0.05],SE组大鼠的海马齿状回(DG区)、CA3区苔藓纤维异常发芽评分较Control组明显升高(P<0.05),瘦素干预明显降低了 SE后的齿状回(DG区)、CA3区苔藓纤维异常发芽评分(P<0.05)。结论:1.新生期大鼠惊厥后瘦素急性期干预提高远期学习认知能力,提高了反应性、平衡性等神经行为学参数,对青霉素所致的二次打击更耐受,表现为存活率上升和惊厥阈延长,还抑制了海马苔藓纤维的异常投射。瘦素的神经保护作用可能与降低惊厥所致皮层和海马组织自噬通路相关蛋白Beclin-1、LC3 II/LC3 I,内质网应激相关蛋白GRP78、ATF4和NLRP3炎症体的蛋白水平增加,以及增多抗凋亡分子Bcl-2的蛋白水平有关。2.新生期持续惊厥急性期血清中clusterin和VEGF升高,瘦素急性期干预阻止血清clusterin的代偿性增高,但进一步增加血清VEGF含量。