研究背景系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种病程反复的自身免疫性疾病,好发于育龄期的女性,主要表现在多个器官的受累,包括肾脏、皮肤、关节、血液和神经系统等的炎症反应,疾病的活动情况会随着时间出现波动,患者血清中会出现以抗核抗体为代表的多种自身抗体。我国的流行病学研究发现,狼疮的患病率高达70/10万。系统性红斑狼疮是一种多因素的复杂病,其临床表现多种多样,多呈隐匿起病,临床症状因个人差异不尽相同,这表明SLE的发病机制可能涉及多个因素的相互作用。系统性红斑狼疮的病因和发病机制至今尚未明确,目前的观点普遍认为SLE的致病因素包括自然环境因素(紫外线照射和化学物质接触等)、生物学环境(细菌、病毒感染等)、社会环境因素(压力、精神创伤等)、基因易感性及内分泌状况等诸多方面。这些因素之间相互作用和影响,最终导致SLE病人体内的免疫功能紊乱。现在针对SLE的治疗仍然是一个很大的争论,虽然可缓解病情和提高病人生活质量的治疗药物被不断的研发出来,但仍然没有一个确定的特异性治疗方法,还有大量病人的症状仍然无法得到彻底或有效的控制,而且长期的炎症和与药物有关的副作用可能会造成永久性的器官损伤,这与该病预后的生命质量下降以及死亡率的上升是密切相关的。因此对系统性红斑狼疮病因及发病机制的研究就显得尤为重要。已有研究表明,辅助性T细胞(Th)在SLE及其它自身免疫疾病的发病中起重要作用。从免疫学上讲,SLE是自身免疫耐受损伤和自身抗原介导的T、B淋巴细胞过度活化所导致的。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是一类含有约22个核苷酸的内源性非编码RNA,主要通过与靶m RNA的3′非翻译区(3′UTR)互补配对,从而造成m RNA降解或蛋白质的表达受到抑制,介导转录后基因调控。人类大约有30%编码蛋白的基因受mi RNAs调节,包括凋亡、细胞分化和分裂、脂代谢、造血和病毒防御等。有研究表明,mi R-326能够通过抑制Ets-1转录因子,进而促进辅助性T细胞17(Th17)的分化;并且mi R-326表达水平与自身免疫性疾病的疾病活动度显著相关。而本课题组已通过前期研究证实,Th17及其相关细胞因子参与了SLE的发病,并首次提出Th17可能作为SLE的治疗靶点。此外,课题组参与的两项全基因组关联研究已经证实Ets-1是SLE的易感基因。由此,我们提出了Ets-1在SLE中可能的作用通路。据此推测mi RNA可能通过调控一些关键的靶基因,从而在SLE的发病中起重要作用。已有文献报道多个mi RNA与自身免疫性疾病有关,它们是否也参与SLE的发病尚不清楚。血浆mi RNA具有含量丰富、性质稳定、易于检测等特征,已作为一类新型生物标志物用于肿瘤等慢性非传染性疾病的早期筛查、诊断和预后评估研究,但在SLE中多为在外周血单核细胞(PBMC)中的表达研究,对SLE患者血浆mi RNA表达谱的报道较少。近年有研究表明micro RNA-101通过靶向调节丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)m RNA的3’UTR区来控制MAPK的水平,同时影响其下游细胞因子的分泌。MAPK信号通路调节众多与SLE发病相关的细胞因子,例如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-a)、白细胞介素1(interleukin 1,IL-1)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)和干扰素(interferon,IFN)等等,它们都在SLE的发病中都扮演着至关重要的角色。有研究显示,mi RNA是通过结合靶m RNA的3’UTR区域从而实现对其表达的调控,无论是IL-6还是TNF-a,它们的3’UTR区域中都含有micro RNA-16的结合位点。此外,许多研究均显示micro RNA-16的过表达会使IL-6、IL-8和TGF-β的表达量下降。因此,我们意图通过ELISA检测IL-6、IL-17和TNF-a的表达量是否与mi R-16-5p和mi R-101-3p的表达相关。基于以上,本研究拟通过mi RNA芯片检测SLE患者和正常对照血浆mi RNA表达水平,并进行独立验证,结合人口统计学资料和临床资料,建立SLE及不同临床亚型的血浆mi RNA表达谱,初步探讨相关mi RNA在SLE发病中的分子机制。之后探讨某些经过验证异常表达的mi RNAs与三种细胞因子IL-6、IL-17和TNF-α的相关。本研究的完成将有助于确定SLE诊断和疾病分型的生物学标5记,为最终发现新的治疗靶点提供科学依据。研究一SLE患者血浆micro RNA的差异表达及验证目的筛查并验证系统性红斑狼疮患者的血浆micro RNA表达谱,探讨micro RNA的表达与SLE发病及其病程的关联性,为SLE的发病机制研究、早期预警、新的治疗方向提供理论依据。方法本项目采用病例对照研究,通过收集SLE患者和正常对照的血液标本,利用mi RNA芯片检测其血浆mi RNA表达水平,并利用Real-time PCR方法进行独立验证,结合人口统计学资料和临床资料,建立SLE及不同临床亚型的血浆mi RNA表达谱,探讨异常表达的mi RNAs与SLE患者临床特征间的关联。从2012年10月开始收集新发SLE病例的血液标本备用。SLE病例主要来自于安徽医科大学第一附属医院风湿免疫科和安徽医科大学附属省立医院风湿免疫科。患者符合1997年美国风湿病学会(ACR)的SLE分类标准;选择年龄、性别与SLE患者匹配的正常人作为对照组。第一阶段拟收集SLE新发病例和对照各30例,用于mi RNA芯片检测血浆中mi RNA的表达水平;第二阶段拟重新收集SLE新发病例38例和对照40例,进行独立验证。mi RNA芯片检测数据使用Gene Pixpro 6.0提取分析,验证实验使用Real-time PCR方法检测mi R-16-5p和mi R-101-3p表达量,以2-ΔCt表示目的mi RNA相对表达量。使用Epi Data 3.1建库,双人录入资料,专人抽查核实。所有数据均采用SPSS 10.01软件进行处理与统计分析,检验水准α=0.05。结果(1)mi RNA芯片的筛查结果发现,在SLE患者血浆中共筛选出97个基因表达上调,182个基因表达下调。以P<0.05为差异有统计学意义,最终筛选出差异表达的人类mi RNAs有158个,其中表达上调有32个基因,表达下调有126个基因。(2)扩大样本量,设计引物对差异表达的人类mi RNAs其中的2个micro RNAs:mi R-16-5p和mi R-101-3p在SLE患者和正常对照中的表达水平进行Real-time PCR验证,结果发现mi R-16-5p和mi R-101-3p在SLE患者血浆中的表达差异仍有统计学意义(P分别为0.001和0.005),与mi RNA芯片筛查预测的结果一致。(3)mi R-16-5p和mi R-101-3p血浆表达水平与SLE患者主要临床特征和实验室检测指标的关联研究中,发现皮疹阳性组与阴性组间、血小板降低组与非血小板降低组间的mi R-16-5p和mi R-101-3p表达水平差异均有统计学意义,统计量和P值分别为Z皮疹=-2.368,P皮疹=0.017;Z血小板降低=-2.146,P血小板降低=0.032和Z皮疹=-2.046,P皮疹=0.041;Z血小板降低=-2.180,P血小板降低=0.029。(4)血浆中mi R-16-5p和mi R-101-3p的表达水平与SLE患者疾病活动度的关联研究,发现SLE患者疾病活动度评分与mi R-16-5p和mi R-101-3p表达水平的相关性均无统计学意义(均有P>0.05)。(5)SLE患者血浆中mi R-16-5p、mi R-101-3p表达水平的相关性分析,结果发现mi R-16-5p表达水平与mi R-101-3p表达水平呈正相关(r=0.675,P<0.001)。结论在SLE患者血浆mi RNA芯片的筛查中,最终筛选出差异表达的人类mi RNAs有158个,其中表达上调的有32个基因,表达下调有126个基因。对mi R-16-5p、mi R-101-3p的Real-time PCR实验验证结果与芯片筛查结果相符。在对血浆mi R-16-5p和mi R-101-3p表达水平与SLE患者临床症状和实验室指标的分析中,显示mi R-16-5p和mi R-101-3p的表达均与皮疹和血小板降低相关,提示这两个mi RNAs可以作为潜在的诊断、判断疾病预后或是复发情况的分子标志物。研究二SLE患者血浆中mi R-16-5p和mi R-101-3p表达水平与IL-6、IL-17和TNF-α水平的相关性研究目的研究mi R-16-5p和mi R-101-3p在SLE患者血浆中的表达水平与IL-6、IL-17和TNF-α水平的关联性,探讨在SLE发病及其病程发展中这3种细胞因子与mi R-16-5p和mi R-101-3p的相互作用。方法研究对象SLE患者的选取标准同研究一,与研究一来源于同一样本人群。ELISA实验最终检测的样本量为37例患者。SLE患者资料收集的内容和方法同研究一。在获得研究对象知情同意后,使用EDTA抗凝采血管抽取所有研究对象外周静脉血5ml,3小时内进行分离血浆处理。同时由专业人员对研究对象进行问卷调查,收集研究对象的一般情况和临床资料,并进行SLE疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)评分。采用ELISA试剂盒检测血浆中IL-6、IL-17和TNF-α的水平,对SLE患者中狼疮肾炎患者和非狼疮肾炎患者、疾病活动期患者和非疾病活动期患者之间血浆IL-6、IL-17和TNF-α水平的差异及其与mi R-16-5p和mi R-101-3p在SLE患者血浆中表达水平的相关性进行分析。采用SPSS 10.01软件进行统计分析,检验水准α=0.05。结果(1)SLE患者血浆中IL-6、IL-17和TNF-α的水平IL-6的血浆浓度为(18.15±7.82)pg/m L,IL-17的血浆浓度为(20.42±10.11)pg/m L,TNF-α的血浆浓度为(33.66±15.18)pg/m L。(2)SLE患者血浆中IL-6、IL-17和TNF-α的水平与SLE患者主要临床特征和实验室检测指标的关联SLE患者管型尿与非管型尿组间的血浆IL-6水平差异有统计学意义(t=3.388,P=0.009);肌炎和非肌炎组、血小板降低组和血小板未降低组间的血浆IL-17水平差异有统计学意义(t肌炎=-5.354,P肌炎<0.001;t血小板降低=-2.267,P血小板降低=0.030);盘状红斑和非盘状红斑组间的TNF-α血浆水平差异有统计学意义(t=5.499,P<0.001)。(3)SLE患者血浆中IL-6、IL-17和TNF-α血浆水平与SLE患者疾病活动度的关联SLE患者血浆IL-6、IL-17和TNF-α水平与其疾病活动度的关联均无统计学意义(均有P>0.05)。(4)SLE患者血浆中IL-6、IL-17和TNF-α水平与mi R-16-5p表达水平的相关性SLE患者血浆IL-6、IL-17和TNF-α水平与mi R-16-5p表达水平的相关性均无统计学意义(均有P>0.05);不同临床症状间、不同实验室检测指标间的比较显示,SLE患者非颧部红斑组血浆TNF-α水平与mi R-16-5p表达水平呈正相关(r=0.928,P<0.001),关节炎组(r=-0.486,P=0.014)、抗Ribosomal P阳性组血浆TNF-α水平与mi R-16-5p表达水平呈负相关(r=-0.488,P=0.047)。(5)SLE患者血浆中IL-6、IL-17和TNF-α水平与mi R-101-3p表达水平的相关性SLE患者血浆中mi R-101-3p表达水平与IL-17水平呈正相关(r=0.329,P=0.047);盘状红斑阴性组、低补体阳性组、抗核抗体阳性组血浆IL-17水平与mi R-101-3p表达水平呈正相关(均有P<0.05),管型尿阴性组、蛋白尿阴性组、脓尿阴性组、抗Ribosomal P阴性组IL-17血浆水平与mi R-101-3p表达水平呈负相关(均有P<0.05);抗Ribosomal P阴性组血浆TNF-α水平与mi R-101-3p表达水平呈正相关(r=0.448,P=0.048)。结论本研究发现SLE患者血浆IL-17水平与mi R-101-3p表达水平相关,未发现SLE患者血浆IL-6、IL-17和TNF-α水平与mi R-16-5p表达水平相关,但是血浆IL-6、IL-17和TNF-α水平与mi R-16-5p和mi R-101-3p表达水平在部分临床特征和实验室检测指标之间存在关联。