苯作为一种环境污染物,广泛存在于石油、汽油、香烟烟雾等物品中。它已被确认为一种人类致癌物。人类苯暴露(例如交通警察在工作场所接触苯)水平增高可观察到含有微核的淋巴细胞增多。苯在各种动物的体内模型及职业接触的工人中都具有遗传毒性,但是在体外培养的哺乳动物细胞模型(包括加入Aroclor1254诱导的肝脏代谢活化系统时),苯都不呈现遗传毒作用。与野生型小鼠比较,CYP2E1敲除的小鼠完全缺乏对苯诱发的骨髓抑制及遗传损伤反应；并且用人肝脏微粒体代谢系统发现苯主要经过CYP2E1的催化而被转化为苯酚；还发现cDNA表达的人CYP2E1可转化苯酚为氢醌、儿茶酚及1,2,4-三羟基苯,后三者是具有一定遗传毒性的代谢物。本研究的目标之一是利用重组稳定表达CYP2E1的哺乳动物细胞测试苯及其羟化代谢物的遗传毒性。作为苯的主要氧化代谢物,苯酚和氢醌在经Ⅱ相代谢(包括硫酸基结合和葡萄糖醛酸基结合)后从体内消除。SULT1A1是人类肝细胞表达的SULT1亚族中最优势的亚型,已有报道人或大鼠SULT1A1可催化苯酚、儿茶酚和氢醌的硫酸基结合反应。但是,SULT1A1在活的哺乳动物细胞中与CYP2E1同时表达的条件下,两种代谢酶在活化、灭活的拮抗作用中依不同的苯浓度有何作用特征尚无报道。我们建立了一个重组表达人CYP2E1和人SULT1A1的V79细胞系(V79-hCYP2E1-hSULT1A1),并建立了将其中一个酶的活性进行特异化学抑制而观察另一个酶作用的模型。本研究拟观察苯及其一系列羟化及氧化代谢物对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞诱发微核的作用,以及其作用的代谢酶相关性,以进一步探讨苯的代谢对其遗传毒性的影响。多氯联苯(Polychlorinated biphenyls, PCBs)是一类持久性环境污染物,至今在国内外环境中普遍存在,在人体中也有一定负荷。很早已发现PCBs对动物的致癌性,最近所有12种二嗯英类似PCBs(分子中含4个以上氯原子)经IARC确认为人类致癌物。一般认为高氯化PCBs在体内代谢速率很低,因此由代谢活化产生遗传毒性的可能较低,低氯化PCBs则存在相对活泼的代谢,可能具有遗传毒作用,但迄今尚无有力证据。CYP2E1也可被PCBs强烈诱导,同时,CYP2E1能催化许多小分子外源性化合物的代谢,包括苯、苯酚、醋氨酚及某些短链卤代脂肪烃；因此我们猜测人CYP2E1有催化某些PCBs化合物代谢活化的可能。为探究这一猜想的真实性,本研究团队前期工作探讨了多种PCBs在表达人CYP2E1的V79细胞诱发微核和基因突变的作用,结果显示多种二氯联苯化合物具有强烈的CYP2E1依赖性遗传毒作用。为进一步探讨三氯与四氯联苯的遗传毒性,本课题选择与两种强作用二氯联苯(PCB5和PCB4)结构相关的一系列三氯联苯,以及环境和人体相对高水平暴露的一系列四氯联苯,观察其诱发V79-hCYP2E1-hSULTlA1细胞诱发微核的作用、作用的酶相关性以及化学物结构-活性关系。1-甲基芘(1-MP)是环境中常见的多环芳烃化合物。已有研究表明其羟化代谢物1-羟甲基芘(1-HMP)可对表达人或大鼠SULT1AK、1C1、2A1的鼠伤寒沙门氏菌；并且1-MP可由多种人或大鼠细胞色素P450酶系(包括CYP2E1)的催化形成1-HMP。然而,1-MP的完整代谢活化过程及其对真核细胞的染色体的作用迄今未见报道。本研究在我们已证实1-HMP的遗传毒性及其SULT1A1依赖性基础上(另一研究生论文有介绍),进一步探讨其原型化合物1-MP对V79-hCYP2E1-hSULT1A1诱发微核和Hprt基因座基因突变的作用。目的1.研究人CYP2E1和人SULT1A1对苯及其羟化代谢物诱发微核作用的影响。2.探讨三氯、四氯联苯代谢活化、遗传毒性及其与人CYP2E1和人SULT1A1的关系。3.进一步揭示1-MP代谢活化相关的对哺乳动物细胞遗传毒作用。方法1.MTT试验对细胞增殖和活性的测定MTT名为噻唑蓝,是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT,同时在细胞色素C的作用下,生成蓝色(或蓝紫色)不溶于水的甲臜(Formazan),甲臜的多少可以用酶标仪在570nnm处进行测定。在通常情况下,甲臜生成量与活细胞数成正比,因此可根据光密度OD值推测出活细胞的相对数量。本实验V79-hCYP2El-hSULT1A1细胞按6800/孔接种于96孔板中,SULT1A1抑制剂五氯酚(PCP,10μmol/L)、CYP2E1抑制剂1-氨基苯三唑(ABT,20、60或200μmol/L)或二甲基亚砜(对照)于22h直至试验终点(48h)存在于培养液中。各受试物于24h至30h或24h至36h存在于培养液中。48h加5mg/LMTT,于4h换二甲基亚砜溶解,于37℃震荡10分钟,然后用酶标仪在570nm波长检测其吸光度。对一部分试验,细胞于6—22h以乙醇(0.2%)诱导CYP2E1稳定的表达。2.微核试验微核试验是检测染色体或有丝分裂器损伤的一种遗传毒性试验方法。无着丝粒的染色体片段或因纺锤体受损而丢失的整个染色体,在细胞分裂后期仍留在子细胞的胞质内成为微核。V79-hCYP2E1-hSULTlAl细胞按3×105/瓶接种于一系列12.5-em2培养瓶。酶抑制剂PCP (10μmol/L)、ABT(20或60μmol/L)或二甲基亚砜(对照)于22h直至试验终点(48h)存在于培养液中。各受试物于24h至30h存在于培养液中。每个处理组5个培养孔。各培养瓶中的细胞于48h以胰蛋白酶消化的方式收获,并观察其微核细胞率。对一部分试验,细胞于622h以乙醇(0.2%)诱导CYP2E1的表达。3.致突变试验细胞在Hprt位点的正向突变(即获得对6-巯基嘌呤的抗性)是本研究中观察的遗传毒作用终点之一。试验参照已报道过的方法,并简略概括如下：细胞以每皿(118cm2,加入20ml培养液)1.0x106的密度接种,6h后加入无水乙醇(终浓度0.2%)以稳定CYP2E1酶蛋白(在需要加入CYP2E1抑制剂的组则不加入乙醇)。于22h以新鲜培养液更换(除去乙醇),并分别加入各抑制剂,即ABT(20μmol/L)、PCP(10μmol/L),或二甲基亚砜(溶剂对照)。2h后,加入各受试物[以NDMA(30μmol/L)、2-MP(5μmol/L)作为阳性对照物,它们是分别依赖CYP2E1和SULT1A1的间接致突变剂],或纯水(溶剂对照)。继续培养3d后,各组细胞以胰蛋白酶消化收集；各组细胞数计数占对照组细胞数的百分比作为各化合物细胞毒性的指标。继续以正常培养液培养3d后,再一次传代并接种细胞于含有6-巯基嘌呤(7μg/ml)的选择性培养液(每个118cm2培养皿接种106细胞,从每个培养瓶收集的细胞被接种至4个培养皿),另外按100细胞/皿的密度接种细胞于3个6cm2培养皿并以正常培养液培养,以测定细胞的克隆形成率。8d后试验终止,经固定和染色,获得每个培养皿细胞集落的数目,以平行接种的各培养皿所得均数作为相应的观察值(克隆形成率和突变率)。每个处理组设立2个初始培养瓶,各组观察值为2个培养瓶相应观察值的均数和标准误。4.统计学分析细胞毒性试验(MTT法)数据以均数±标准差(x±s)表示,采用方差分析进行统计学检验；各组微核细胞率的比较则采用卡方检验,以P<0.05为差异有统计学意义；突变率的分析则采用确切概率(Fisher)法。结果1.苯、它的各个羟化代谢物和1,4-苯醌对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞均不同程度诱发微核。首次观察到苯和苯酚在体外细胞中的遗传毒性作用；首次观察到人CYP2E1可继续转化氢醌、儿茶酚及三羟基苯为遗传毒性增高的代谢物。维生素C可明显降低儿茶酚、氢醌和三羟基苯对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞的诱发微核作用,但对1,4-苯醌诱导的微核形成无影响。2.受试PCBs对V79对照细胞均无细胞毒作用,也不诱发微核；然而,本论文涉及的12个PCBs中有10个都对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞强弱不等地诱导细胞毒和/或微核形成,并且其作用呈现明显的结构-活性关系。受试物中仅有PCB77和PCB81(为二嗯英类似的四氯联苯)对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞未表现任何毒性。CYP2E1抑制剂ABT可阻断PCBs的细胞毒作用,并降低其诱发微核的作用；而SULT1A1的抑制剂PCP则强化某些PCBs的作用。表明人CYP2E1是介导所观察到代谢活化作用的关键酶。3.1-MP对缺乏生物转化酶的V79对照细胞均无细胞毒或遗传毒作用。然而,它对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞呈现轻度细胞毒作用,并具有明显的诱发微核与基因突变作用,后者均呈现浓度依赖性效应。CYP2E1和SULT1A1的抑制剂(ABT和PCP)均可抑制1-甲基芘诱发的细胞毒、微核形成及致突变作用。结论(1)人CYP2E1可通过连续的催化反应转化苯直至终致突变物(可能为1,4-及1,2-苯醌)形成；苯的二羟基代谢物由人SULT1A1催化的硫酸基结合反应可能代表苯的一个解毒途径。氢醌、儿茶酚、三羟基苯在人CYP2E1作用下的进一步活化可能涉及这些化合物中羟基的氧化,进一步形成亲电子性的醌类衍生物。(2)许多三氯、四氯联苯化合物经人CYP2E1可活化为遗传毒性代谢物,并呈现明显的结构-活性关系。依赖于细胞内的人CYP2E1活性,2,3,3’-三氯联苯和2,3,4’-三氯联苯具有最强的诱发微核及细胞毒作用；尽管二嗯英类似的四氯联苯无活性,其它结构的四氯联苯可强弱不等地诱发微核。人SULT1A1对某些PCBs的活性代谢物则具有一定解毒作用。(3)本研究证实人类CYP2E1与SULT1A1可协同作用以活化1-MP,使其在不呈现细胞毒作用的较低浓度即具强烈诱导基因突变与染色体畸变的作用。