【摘 要】
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漆酶主要分布于真菌、细菌等微生物体中,真菌漆酶在工业领域中应用广泛。冰川环境独特,冰川覆盖下的生命循环系统可能大部分由微生物组成,而冰川低温环境中微生物为了适应环境会演变出特有的生物特性,如产耐低温漆酶的真菌。为了获得在低温条件下具有较好催化性能的冷适应漆酶,提升漆酶在实际应用中效率,拓宽其应用范围,本研究从冰川冻土中分离筛选了具有较好低温产漆酶能力的真菌菌株并进行菌种鉴定,优化了目标菌株的漆酶发
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漆酶主要分布于真菌、细菌等微生物体中,真菌漆酶在工业领域中应用广泛。冰川环境独特,冰川覆盖下的生命循环系统可能大部分由微生物组成,而冰川低温环境中微生物为了适应环境会演变出特有的生物特性,如产耐低温漆酶的真菌。为了获得在低温条件下具有较好催化性能的冷适应漆酶,提升漆酶在实际应用中效率,拓宽其应用范围,本研究从冰川冻土中分离筛选了具有较好低温产漆酶能力的真菌菌株并进行菌种鉴定,优化了目标菌株的漆酶发酵条件,进行了发酵液漆酶的分离纯化及其酶学性质的研究,探索了该漆酶在低温果汁澄清应用中的可行性。本研究主要结论如下:（1）本研究以高寒地带冰川冻土为微生物来源,土壤样品经过富集培养后稀释涂平板,采用ABTS平板变色圈方法筛选出5株具有较好低温产漆酶能力的真菌菌株。采用分子鉴定方法获得筛选的5株菌株的种属信息,其中菌株F08被鉴定并命名为Peniophora simulans F08。5株真菌都能液体发酵产漆酶,其中P.simulans F08在同等条件下产漆酶能力最强,15℃发酵7天,酶活达到240.0U/L,选定菌株F08作为低温高效产漆酶真菌菌株并用于后续研究。（2）以P.simulans F08为目的菌株,对液体发酵产漆酶培养基成分和培养条件分别进行单因素和响应面优化实验,获得的最佳培养基配方为:葡萄糖3 g/L,NH4Cl 0.1 g/L,Cu SO4·5H2O 0.14 g/L,KH2PO4 1 g/L,Fe SO4·7H2O 0.01 g/L,Mg SO4·7H2O 0.095 g/L,Ca Cl2·2H2O 0.1 g/L;最优培养条件为:初始p H为4.7,温度为22℃,接种量为13%（v/v）,装液量为100 m L/250 m L,转速150 r/min。在最佳培养基组成和最优培养条件下,进行P.simulans F08液体发酵产漆酶的验证实验,发酵6天后漆酶活力达到627.8 U/L,比优化前的发酵酶活（240.0 U/L）提高了1.6倍,表明培养基成分和培养条件优化是提高P.simulans F08漆酶产量的有效手段。（3）通过硫酸铵沉淀、DEAE阴离子交换色谱和Hi Prep Sephacryl S-200凝胶过滤色谱对发酵液固液分离后粗酶液中的漆酶进行了分离纯化,纯化倍数达58.0倍,酶活回收率为28.1%,SDS-PAGE和Native-PAGE结果表明纯化后的漆酶是具有催化活性的电泳纯漆酶,该漆酶分子量约为68 k Da。在此基础上的P.simulans F08漆酶酶学性质研究表明,以邻苯二酚为底物,该漆酶的最适反应温度为50℃,4℃下仍保留53.5%的酶活,温度适用范围广;在30-50℃下温浴4 h后,该漆酶酶活保留97%以上,P.simulans F08漆酶是一种热稳定的冷适应漆酶。P.simulans F08漆酶的最适p H为3.5,在p H 3-6条件下孵育12 h后仍能保留93%以上酶活。Cu2+、Mg2+、Ca2+对该漆酶活性有增强作用,而Fe2+、Co2+、Fe3+能显著降低漆酶活力。SDS、EDTA和Tween 80是较为温和抑制剂,而DTT和H2O2对该漆酶抑制作用明显,且高浓度抑制作用更强。P.simulans F08漆酶对邻苯二酚表现出较好的底物亲和力,其酶动力学参数Km值为0.83 mmol/L,Vmax值为2.63μmol/L/min;该漆酶底物谱较为宽泛,能够氧化大部分酚类和非酚类物质,2,2-连氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）最易被其催化,其不能催化氧化酪氨酸和阿魏酸。P.simulans F08漆酶低温苹果汁澄清的结果表明,在15℃,30 min处理条件下,苹果汁澄清后色值降低65.7%,浊度下降63.5%,透光率提高37.4%,65.8%的总酚保留在果汁中,各指标均优于商业化漆酶同等条件下的处理效果。由此可见,P.simulans F08漆酶在低温果汁澄清及其他低温食品加工中具有较好的应用潜力。
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