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第一部分:碱基切除修复基因hMYH和hOGG1的基因突变与间质性肺疾病易感性在中国人群中的关系研究 间质性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)是指以肺泡壁为主并包括肺泡周围组织及其相邻支撑结构病变的一系列疾病。特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)和机化性肺炎（organizing pneumonia，OP）都是ILD分类中较为常见的类型。ILD发病机制目前尚不十分清楚，大体上其发病病因包括环境触发因素和遗传易感性。 ILD发病过程中伴随着内源性活性氧(reactive oxygen species，ROS)增高。内源性活性氧的上升导致DNA氧化损伤。DNA氧化损伤被认为在多种肺疾病如ILD的发病机理和疾病进程中扮演着重要角色。修复DNA氧化损伤的一个重要机制是碱基切割修复(base excision repair, BER)途径。hOGG1基因(human oxoguanine glycosylase 1，hOGG1)和hMYH(human MutY homolog)基因是碱基切割修复途径的两个重要成员，在修复DNA氧化损伤过程中起到关键作用。研究发现，联合敲除hOGG1和hMYH基因可导致小鼠更易罹患肿瘤，这表明hOGG1和hMYH基因功能联合失活可能伴随着疾病发病风险上升。 越来越多的研究显示在人类基因组中的Alu序列插入与许多疾病相关，而AluYb8是最活跃的Alu亚家族之一。在中国人群中，我们组首次发现并报道hMYH基因的第15内含子存在AluYb8序列插入突变。5非翻译区(5 UTR)通常在转录水平及转录后水平上影响基因表达。疾病相关基因5UTR的突变可能严重影响的疾病进程。因此，在本研究中，我们试图分析在ILD患者中hMYH基因第15内含子AluYb8序列插入突变以及hOGG1基因编码5UTR的第一外显子区的遗传突变，并进一步分析其突变与ILD遗传易感性的相关性。为此，我们进行了如下研究: 在临床病例对照研究中，随机募集226位ILD患者，441位健康个体和103位肺炎患者。分离所有样本外周血淋巴细胞并提取其基因组DNA。运用PCR及琼脂糖凝胶电泳技术，鉴定分析hMYH基因的Alu Yb8序列插入。高分辨率溶解曲线（High Resolution Melt，HRM）分析技术和DNA测序用于鉴定分析hOGG1基因编码5UTR的第一外显子区的突变。hMYH和hOGG1基因变异与ILD发病易感性研究的统计方法采用四格表卡方检验和非条件Logistic回归分析。 我们的结果显示，ILD患者中hMYH基因AluYb8插入变异的等位基因频率明显高于正常对照(P=0.012，OR=1.338，95％ CI:1.065-1.681); OP患者与正常对照比较，差异亦见显著性(P=0.006，OR=2.099，95％CI:1.252-3.519)。在IPF患者中，尽管hMYH基因AluYb8插入的等位基因频率高于正常对照，但差异未达到显著标准(P=0.234，OR=1.796，95％ CI:0.702-4.594)。我们在hOGG1基因编码5UTR的第一外显子区突变分析中检测发现5个突变位点:c.-18 G＞T，c.-23 A＞G，c.-45 G＞A，c.-53 G＞C和c.-63 G＞C。其中c.-63 G＞C为首次报道。在后续的研究中我们发现，c.-18 G＞T突变增加了ILD的发病风险(P=0.186，OR=1.986，95％ CI:0.736-5.364)。通过联合分析hMYH基因AluYb8插入突变和hOGG1基因c.-18 G＞T突变发现，二者共同发生伴随着更高的ILD发病风险(P=0.06, OR=3.022,95％ CI:0.976-9.352)。 总而言之，本研究表明hMYH基因AluYb8插入变异和hOGG1基因c.-18G＞T突变构成ILD的发病的风险因素。 第二部分:特发性肺纤维化模型大鼠肺成纤维细胞miRNA表达谱变异及鸢尾黄素对特异性miRNA表达的影响 作为间质性肺疾病的常见分类之一，特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是由未知病因引起的慢性进展性纤维化和最终致命的间质性肺炎。IPF预后差，诊断后生存期为3-5年左右。在特发性肺纤维化的发病过程中，成纤维细胞被募集到肺组织异常增殖，从而导致肺纤维化发生。然而，在发病机制上，特发性肺纤维化有别于其他的间质性肺病，即针对免疫细胞靶点的免疫抑制剂对其治疗作用甚微。目前临床上对IPF的治疗一般采用皮质类固醇(corticosteroids)结合免疫抑制剂或细胞毒药物，但效果不甚理想。因此，该疾病至今尚无有效地干预靶点。 鸢尾黄素，是植物鸢尾的根茎的主要组成之一。作为传统中药鸢尾主要用于抗炎治疗如治疗肝硬化。研究表明，鸢尾黄素能够有效抑制中国仓鼠肺成纤维细胞系(V79-4)细胞增殖并诱导凋亡。依据这一线索，我们在本研究中探讨鸢尾黄素对IPF可能的治疗作用及其生物靶点，意在于发展IPF干预、治疗的新思路。为此，我们初步开展了以下研究: 通过给大鼠气管内滴注博莱霉素，建立IPF动物模型。分析动物模型各项指标包括肺指数分析，羟脯氨酸含量以及组织病理学分析表明我们成功建立了IPF疾病模型。体外原代培养建模和对照动物的肺成纤维细胞。 鸢尾黄素药物浓度梯度处理IPF疾病组和对照组来源的原代培养肺成纤维细胞。我们运用MTT和CFSE实验分析细胞增殖情况发现，鸢尾黄素显著抑制IPF疾病模型来源的肺成纤维细胞的增殖。PI染色流式细胞术分析细胞周期和凋亡表明鸢尾黄素对细胞周期及凋亡无作用。 MicroRNAs芯片分析及实时定量PCR验证分析IPF模型组以及正常组肺组织发现miR-99b，miR-323，miR-338*在不同时间点呈一致显著性差异表达。进一步研究发现，鸢尾黄素可显著上调IPF模型来源肺成纤维细胞中miR-338*的表达。生物信息学预测分析发现，IPF发病相关的关键基因LPA1是miR-338*潜在调控靶点之一。我们通过免疫印迹和免疫组织化学实验发现，鸢尾黄素显著抑制了IPF模型来源肺成纤维细胞中LPA1的蛋白表达。 总之，鸢尾黄素抑制肺成纤维细胞的增殖且增强其miR-338*的表达，从而可能间接抑制LPA1的蛋白表达，最终对IPF的发病起到调控作用。该研究为进一步探讨鸢尾黄素干预治疗IPF奠定了工作基础。