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中枢神经系统(central nervous system,CNS)损伤后修复和再生能力有限,受损的神经元死亡后无法被取代。因此,CNS的损伤通常非常严重并且往往是不可逆的。近年来,干细胞治疗的兴起为神经系统损伤的治疗开辟了新的道路。人脐带来源的间充质干细胞(human umbilical mesenchymal stem cells,HUCMSCs)由于其方便取材,免疫原性低,适用于自体移植等优点,已应用于多个领域的临床治疗。HUCMSCs具有转分化成神经元的潜能,以HUCMSCs进行转分化成神经元的深入研究,能够为临床治疗神经系统疾病奠定基础。MicroRNA(miRNA)在神经发育成熟过程中起重要作用,miRNA是一种内源性含20～24个核苷酸的非编码单链小RNA,一般通过结合信使RNA(mRNA)3’端非翻译区(3’untranslated regions,3’UTRs)从而诱导靶mRNA降解或者抑制mRNA翻译,进而实现对靶基因的转录后调控。近年来有研究表明miR-9和miR-124调控神经发育过程,高表达miR-9和miR-124可将一些非神经类细胞转分化为神经元,而其通过靶向哪些分子调控转分化过程有待进一步研究。在胚胎发育过程中,多聚嘧啶区结合蛋白(polypyrimidine tract binding protein,PTB’)参与调控神经元的发生和成熟。PTB是一种典型的mRNA前体剪切抑制因子,一般结合于核酸序列中富含嘧啶碱基的区域,参与mRNA前体剪切的调控。在哺乳动物基因组中,PTB家族由三个成员组成,PTBP1在大多数类型细胞中表达,PTBP2只在神经系统中表达,PTBP3主要在免疫细胞中表达。近年来有研究表明,通过干扰PTBP1可以将非神经类细胞转分化成神经元,miRNA靶基因预测软件分析显示PTBP1可能是miR-9和miR-124的靶基因。通过双荧光素酶报告基因实验,我们能够明确miR-9和miR-124是否直接靶向PTBP1。本实验室前期为研究miR-9和miR-124与HUCSMCs成神经转分化之间的关系,构建了同时高表达miR-9和miR-124的慢病毒载体。HUCMSCs感染高表达miR-9和miR-124慢病毒3天后换N3培养基诱导转分化7天,得到Tuj1阳性细胞,同时转分化得到的Tuj1阳性细胞中PTBP1表达降低。因此,干扰PTBP1是否能够诱导HUCMSCs转分化神经元以及如何提高其转分化效率,成为我们另一个主要研究内容。为证明miR-9和miR-124是否直接靶向PTBP1,我们克隆包含一个miR-9保守结合位点和两个miR-1 24保守结合位点的PTBP1 3’UTR区域片段,在此基础上通过PCR定点突变获得miR-9和miR-124失活型3’UTR片段,将获得的片段连接到双荧光素酶报告基因质粒载体中,从而获得包含野生型和突变型PTBP1 3’UTR片段的双荧光素酶报告基因载体。使用以上载体进行双荧光素酶报告基因实验,结果表明miR-9和miR-124能够通过靶向PTBP1的3’UTR区域从而调节PTBP1的表达。我们通过慢病毒感染HUCMSCs干扰PTBP1的表达,使细胞中PTBP1 mRNA水平降低85%,蛋白水平降低90%,病毒感染3天后换为N3培养基培养7天,得到Tuj1阳性神经元,转分化效率约为20%。分别检测感染第3天和N3培养基培养7天细胞相关基因表达,结果显示PTBP1表达下降,PTBP2先升高后下降,miR-9和miR-124表达逐渐升高,均符合神经元成熟规律;因此,我们猜测HUCMSCs转分化成神经元的过程是miR-9、miR-124、PTBP1三者相互平衡、相互制约的结果。为了提高转分化效率,我们将感染病毒3天后的HUCMSCs与星形胶质细胞共培养,转分化效率可提高至32%。为了进一步提高分化效率,本实验采用了干扰PTBP1联合同时高表达miR-9和miR-124诱导HUCMSCs转分化为神经元的方案,转分化7天后得到Tuj.1阳性神经元,转分化效率约为45%。综上所述,PTBP1是miR-9和miR-124的共同靶基因,干扰PTBP1可以诱导HUCMSCs转分化成神经元,星形胶质细胞共培养和干扰PTBP1联合高表达miR-9和miR-124都提高神经元转分化效率,为HUCMSCs来源的神经元用于临床治疗奠定理论基础。