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目的:建立测定大鼠血浆中匹伐他汀和柳氮磺吡啶的LC-MS/MS分析方法,研究3~25mg·kg-1剂量范围内辣椒素(capsaicin,CAP)对大鼠体内匹伐他汀和柳氮磺吡啶药代动力学的影响,并通过检测CAP处理后的大鼠肝脏组织中Slco1b3(Oatp1b2)和 Abcg2(Bcrp) mRNA表达水平,探索 CAP引起大鼠体内Oatp1b2的底物匹伐他汀和Bcrp的底物柳氮磺吡啶药代动力学变化的调控机制。 方法: 1.建立测定大鼠血浆中匹伐他汀和柳氮磺吡啶的LC-MS/MS分析方法 大鼠血浆中匹伐他汀的含量测定采用液相色谱-质谱联用仪。采用 XB-C18(2.1mm×150mm,5?m)为色谱柱,以乙腈:乙酸铵水溶液(20Mm,含0.3%甲酸)(75:25,v/v)为流动相,以替米沙坦为内标。大鼠血浆中柳氮磺吡啶的含量测定采用液相色谱-质谱联用仪,色谱柱为XB-C18柱(2.1mm×100mm,5μm),流动相为甲醇:0.1%甲酸-水(80:20,v/v),以吡格列酮为内标。 2.辣椒素对大鼠体内匹伐他汀和柳氮磺吡啶药代动力学的影响 以SD雄性大鼠为研究对象,将30只大鼠按体重随机分为5组。设置分组如下:空白对照组0.5%CMC-Na,4mL·kg-1;环孢素组10mg·kg-1;CAP-Ⅰ组3mg·kg-1;CAP-Ⅱ组8mg·kg-1;CAP-Ⅲ组25mg·kg-1,连续灌胃给药7天。于第7天给药30min后,再灌胃给予匹伐他汀1mg·kg-1在给药后不同时间点断尾采血,分离出血浆后存放于-20℃冰箱中备用。采完最后一个点后取出给予匹伐他汀的大鼠肝脏组织,用液氮处理后置于-80℃冰箱中保存备用。用LC-MS/MS法测定血浆中匹伐他汀的浓度。将各处理组的血药浓度-时间数据用DAS3.2.2处理,计算主要的药代动力学参数 AUC0-t、AUC0-∞、t1/2Z、Tmax、Vz/F、CLz/F、Cmax,将抑制剂组和CAP-Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ组与空白对照组对比进行统计学分析。 CAP对大鼠体内柳氮磺吡啶药动学影响实验分组和预处理同上,于第7天给药30min后,再灌胃给予柳氮磺吡啶20mg·kg-1,在给药后不同时间点断尾采血,分出血浆后存放于-20℃冰箱中备用。用LC-MS/MS法测定血浆中柳氮磺吡啶的浓度。将各处理组的血药浓度-时间数据用DAS3.2.2处理,计算主要的药代动力学参数AUC0-t、AUC0-∞、t1/2Z、Tmax、Vz/F、CLz/F、Cmax,将抑制剂组和CAP-Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ组与空白对照组对比进行统计学分析。 3.探索辣椒素与大鼠体内匹伐他汀和柳氮磺吡啶相互作用的机制 采用实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)法检测大鼠肝脏组织中Slco1b3和Abcg2 mRNA的表达。采用SPSS17.0进行多组间单因素方差分析,将抑制药组和CAP-Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ组与空白对照组对比进行统计学分析。 结果:匹伐他汀检测方法显示该方法在0.57~577ng·mL-1范围内线性良好,定量下限为0.57ng·mL-1。匹伐他汀日内、日间精密度(RSD%)均<15.00%,低、中、高3种浓度的提取回收率为83.73~86.85%。样品室温放置2h、长期-80℃冷冻30天、反复冻融3次及样品处理后4℃放置8h条件下稳定性良好。 柳氮磺吡啶检测方法显示该方法在15.6~1000ng·mL-1范围内线性良好,定量下限为15.6ng·mL-1。柳氮磺吡啶日内、日间精密度(RSD%)均<15.00%,低、中、高3个浓度的提取回收率为76.46~80.21%。样品室温放置2h、长期-80℃冷冻30天、反复冻融3次及样品处理后4℃放置8h条件下稳定性良好。 连续7天灌胃给予大鼠不同剂量的CAP后,抑制剂组和CAP-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组匹伐他汀的Cmax均升高,并且抑制剂组和CAP-Ⅱ组升高显著,有统计学意义(P<0.05);抑制剂和3个剂量CAP组分别与空白对照组相比清除率均减慢,但除抑制剂组(P<0.01)外,3个CAP组均无无统计学意义;抑制剂组Tmax显著升高,但3个剂量CAP组的Tmax均无变化;抑制剂组AUC0-t和AUC0-∞均是空白对照组的3.4倍(P<0.05),CAP-Ⅱ组AUC0-t和AUC0-∞均是空白对照组的2.1倍(P<0.05),有显著性差异。对柳氮磺吡啶的影响为抑制剂组的半衰期显著升高(p<0.05),其他参数无显著性差异;CAP-Ⅰ组(3mg·kg-1)的AUC0-t和AUC0-∞均是空白对照组的1.5倍,有显著性差异(p<0.05),清除率比空白对照组减少了33%,有显著性差异(p<0.05);中剂量CAP组(8 mg·kg-1)的AUC0-t和AUC0-∞均是空白对照组的1.6倍,有显著性差异(p<0.01),清除率比空白对照组减少了38%,有显著性差异(p<0.01);高剂量CAP组(25mg·kg-1)的AUC0-t和AUC0-∞分别是空白对照组的1.6和1.7倍,有显著性差异(p<0.01),清除率比空白对照组减少了42%,有显著性差异(p<0.01),说明连续7天灌胃给予环孢素和CAP能提高柳氮磺吡啶在大鼠体内的药动学AUC0-t和AUC0-∞,降低柳氮磺吡啶在大鼠体内的清除率,并且随着 CAP给药剂量的增加,AUC0-t和AUC0-∞的增加和清除率的降低更加明显。 RT-PCR的实验结果表明,在肝脏组织中,与空白对照组相比,不同剂量CAP组Abcg2的mRNA表达均呈现出不同程度的下降趋势,而Slco1b3的mRNA表达量在不同剂量CAP组中的趋势不同,且均无显著性差异。 结论: 1.连续7天灌胃给予大鼠8mg·kg-1CAP显著提高大鼠体内匹伐他汀的Cmax和生物利用度。 2.连续7天灌胃给予大鼠3、8、25mg·kg-1CAP显著提高大鼠体内柳氮磺吡啶的生物利用度,延长其半衰期。 3.CAP抑制大鼠肝脏组织中Abcg2的基因表达,而对Slco1b3的基因表达无明显影响。 4.CAP可能通过下调大鼠肝脏组织中的Abcg2的基因表达,使大鼠肝脏中的Bcrp转运体的量减少,从而与匹伐他汀和柳氮磺吡啶在大鼠体内产生药物相互作用,这可能是CAP提高匹伐他汀和柳氮磺吡啶生物利用度的重要机制。