背景与目的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC,简称肝癌)位居恶性肿瘤发病率的第5位,死亡率第3位,其中一半以上病例发生于中国。肝癌起病隐匿,进展迅速,转移快,死亡率高,对我们的生命健康造成了很大威胁。近些年人们大多认为肝癌的发生是多途径、多因素、多阶段长期作用的结果。目前已知的导致肝癌发生的相关因素包括外部促癌因素(感染HBV、IICV、细菌和寄生虫,药物,摄入黄曲霉毒素,饮酒,非酒精性脂肪肝,胆管疾病与肝硬化等)和患者自身遗传因素,其中HBV感染尤为重要。它们可损伤肝组织,使肝细胞异常增生,严重损坏肝脏实质结构和胆管系统,直接或间接地导致肝癌发生目前治疗肝癌的首选治疗方法是外科手术切除,它联合应用TACE、射频消融术、放疗和中医疗法等,可明显提高肝癌患者的5年生存率,而肝移植和生物治疗是其新热点。肝癌的发生发展过程很复杂,常同时存在原癌基因突变、抑癌基因缺失、细胞周期调控与细胞信号转导基因、免疫相关基因和DNA修复基因的异常表达等。分子生物学研究正为肝癌的早期诊断与分子靶向治疗寻求新的突破。最早发现且应用最广泛的血清肿瘤标志物是AFP (a-fetoprotein),然而它的假阴性率大于30%,当前尚无任何标志物可诊断所有肝癌,我们需要通过联合检测来提高肝癌的早期检出率,因此发现新的标志物有重大意义。前期通过运用寡核苷酸芯片筛选出肝癌和肝硬化差异基因表达谱,发现多形性腺瘤基因1(pleomorphic adenoma gene 1, PLAG1)在肝癌中是一个明显高表达的基因,而ⅡA分泌型磷脂酶A2 (group IIA secretory Phospholipase A2, PLA2G2A)基因是一个明显低表达的基因。PLAG1位于人类染色体8q12,已发现在腮腺多形性腺瘤、脂母细胞瘤等多种肿瘤中异常表达,其可通过激活靶基因促进细胞增殖引起肿瘤的发生发展。PLA2G2A属磷脂酶A2家族中的一种,已发现PLA2G2A在抗菌、炎症反应和抑制肿瘤等方面起重要作用,在胃癌、乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤中异常表达。通过应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),蛋白免疫印迹(Western blot)与免疫组织化学(immunohistochemistry)方法检测PLAG1、PLA2G2A在人正常肝脏、肝硬化和肝癌组织中的表达情况,分析PLAG1及PLA2G2A在肝癌发生发展过程中的作用,旨在为肝癌早期诊断和分子靶向治疗找出理想的候选基因。材料与方法正常肝组织19例,肝硬化组织15例,肝癌组织39例,均取自河南省人民医院2010年3月-2010年5月肝脏手术切除标本。正常肝组织乙肝表面抗原阴性,肝硬化、肝癌组织乙肝表面抗原均阳性,诊断均经病理证实。按照Simply P总RNA提取试剂盒操作步骤分别提取标本中总RNA,按RT-PCR试剂盒操作程序行逆转录聚合酶链式反应,扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定,并对PLAG1和PLA2G2A扩增产物进行扫描和半定量分析。Tricine-SDS-PAGE电泳分离蛋白,转膜,封闭后一抗孵育,二抗稀释液孵育,ECL化学发光显影。各组标本均常规HE染色,经病理学分级,运用SP法行免疫组织化学检测,用显微扫描成像系统拍照、储存图片。数据应用SPSS17.0统计软件进行成组设计资料的单因素方差分析后LSD-t检验、x2检验和Fisher’s精确检验及Kruskal-Wallis秩和检验的统计学处理,以0α=0.05为检验水准。结果1.电泳结果证明已提取了高纯度的RNA,目的基因条带清晰,内参基因条带明亮。2. RT-PCR和Western blot实验表明：PLAG1mRNA和蛋白在肝癌中均呈上调表达,肝癌组、肝硬化组和正常组PLAG1mRNA阳性表达率分别为：87.2%、46.7%和26.3%；三组间差异有统计学意义(x2=22.47,P<O.01)。PLAG1蛋白阳性表达率分别为：84.6%、40.0%和15.8%,三组间差异有统计学意义(x2=27.15,P<O.01)。PLA2G2A mRNA和蛋白在肝癌中均呈下调表达,肝癌组、肝硬化组和正常组PLA2G2A mRNA阳性表达率分别为：28.2%,66.7%和89.5%；三组间差异有统计学意义(x2=20.83, P<0.01)。PLA2G2A蛋白阳性表达率分别为：25.6%,73.3%和84.2%,三组间差异有统计学意义(x2=21.41,P<0.01)。RT-PCR与Western blot结果一致。3.免疫组织化学实验结果表明：不同分化程度(x2=13.75,P<0.01)和不同病理分级(x2=24.23,P<O.01)的HCC组织PLAG1表达强度差异有统计学意义。肝癌组织分化程度越低,Edmondson分级程度越高,PLAG1表达程度越高。结论1.在mRNA及蛋白水平上,PLAG1在肝癌组织中呈高程度的表达,说明PLAG1可能在肝癌形成的过程中起着非常重要的作用。PLA2G2A在肝癌组织中明显低表达,说明PLA2G2A的表达缺失可能与肝癌的发生发展有关。2. PLAG1表达强度与肝癌组织临床病理学特征有关,根据PLAG1的表达程度有助于对肝癌组织进行临床病理分级。3. PLAG1可能成为肝癌早期诊断的候选基因,PLA2G2A可能成为抗肿瘤的候选靶向药物。研究其异常表达的分子机制,有望能为肝癌提供一种潜在的分子靶向治疗途径。