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植物受到干旱、低温和盐等逆境境胁迫时,植物内源ABA浓度升高,环境信号通过一系列信使传递,并诱导多种基因转录和转录后水平的改变,而ABA信号传导通路是一条重要的与胁迫应答相关的信号传导途径,且植物激素ABA在种子成熟萌发、植株生长发育和对逆境胁迫应答中也有关键调控作用。ABA信号通路作为一个复杂的磷酸化级联反应,涉及多种正、负调控因子。通过对拟南芥的分子遗传学研究,已鉴定出多种ABA信号传导途径的组分,包括蛋白激酶、蛋白磷酸酶和多种转录因子等,其中Ser/Thr蛋白磷酸酶PP2C家族成员在ABA信号转导中作为负调控因子起重要作用。目前,植物中发现的多种PP2C类磷酸酶均参与ABA的信号传导。迄今为止,已经发现拟南芥PP2C家族的成员如ABI1、ABI2、HAB1、HAG3和PP2CA等,它们均为ABA信号途径负调控因子,其中ABI1是ABA信号转导途径中的核心组分。它们通过改变ABA信号的强弱调控植物的胁迫应答,从而影响与ABA信号传导相关的植物表型和生理性状,且认为ABI1基因的表达水平可影响植物的生长发育和抗逆性。盐芥是与拟南芥近缘的植物耐逆分子遗传学研究模式系统。因此对盐芥ThABI1基因的克隆以及对其功能、机理等方面的研究有助于进一步深化对植物ABA信号途径的认识,从而更好地理解盐芥耐胁迫机理,为植物的耐逆性改良奠定基础。本研究主要包括以下几方面内容:1.盐芥ThABI1基因cDNA全长的克隆及序列分析。2.野生型盐芥ThABI1基因的耐逆研究:干旱、盐、冷和ABA处理野生型盐芥后,实时定量PCR检测ThABI1基因的表达水平,发现以上胁迫条件下ThABI1基因的表达水平均有不同程度的上调。3.过量表达盐芥ThABI1研究其功能:ThABI1全长基因与带有Basta筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3301连接,构建35S∷ThABI1过量表达载体,并导入农杆菌后进行盐芥花序侵染;0.2%Basta除草剂筛选盐芥转化子;对初筛的转基因植株进行分子鉴定:PCR扩增其Bar基因(500bp),其中7株获得PCR阳性结果,说明35S∷ThABI1的pCAMBIA3301H过量表达载体已整合到野生型盐芥的基因组。4.盐芥ThABI1的基因沉默研究其功能:将ThABI1基因的部分序列(218bp)构建ThABI1∷pCAMBIA3301基因沉默表达载体;并导入农杆菌后进行盐芥花序侵染;0.2%Basta除草剂筛选盐芥转化子。对初筛的盐芥转基因植株进行分子鉴定:(1)PCR扩增其Bar基因(500bp),其中6株获得PCR阳性结果,说明ThABI1∷pCAMBIA3301沉默载体已整合到盐芥野生型的基因组;(2)盐芥转基因株系的实时定量PCR分析发现,部分转基因株系ThABI1基因表达水平与野生型相比有不同程度的降低;(3)60μmol/L ABA分别处理转基因植株0、3和6小时后,实时定量PCR检测ThABI1基因的表达水平,结果表明转基因植株中ABI1基因的表达水平受ABA诱导上调。说明ThABI1参与了植株对环境胁迫的响应,且对干旱和外源ABA诱导较敏感;ThABI1的进一步分子鉴定和功能研究仍在进行中。5.拟南芥AtHKT1启动子∷ThHKT1转基因植株的耐逆研究:对拟南芥AtHKT1启动子∷ThHKT1转基因纯合子植株(宋开侠师姐获得)进行以下分析:(1)0、75、125 mmol/L不同浓度NaCl分别处理拟南芥HKT1突变体(sas2-1)、野生型和拟南芥转基因植株,分别测定其植株的Na+、K+含量,结果表明较之于野生型,转基因植株和sas2-1地上部分均积累更多Na+,但sas2-1表现更加明显,说明盐胁迫条件下AtHKT1启动子∷ThHKT1的转基因植株可减少Na+转运进入拟南芥sas2-1地上部分;(2)0、50、100 mmol/L不同浓度KCl分别处理拟南芥转基因植株、野生型及sas2-1,测定其植株的Na+、K+含量,结果表明转基因植株地上部分的K+含量高于sas2-1和野生型。可见,高钾条件下AtHKT1启动子∷ThHKT1的转基因植株提高了拟南芥HKT1突变体植株中的K+含量。由此初步推断ThHKT1具有K+转运功能并可调控Na+、K+离子均衡。