背景：SARS coronavirus(SARS-CoV)感染引起严重急性呼吸道综合征(Severe AcuteRespiratory Syndrome，SARS)的全球爆发严重危害了人类健康和社会经济。对SARS-CoV的研究主要集中于病原的致病机制、SARS的源头和传播途、防治药物和疫苗的研制和开发。对于这种新现病毒，病毒抗原表位的研究是SARS-CoV众多研究的基础。SARS-CoVB细胞优势表位的确定及对其免疫学特性的研究将为SARS特异性诊断试剂的研制、疫苗和抗病毒药物的设计与合成奠定基础。目的：筛选SARS-CoV B细胞优势表位，对其进行特异性和敏感性检测、抗体效价测定等一系列免疫学特性研究，分析各表位的潜在应用前景，为SARS特异性诊断试剂、SARS疫苗和抗病毒药物的研制奠定基础。 方法：应用随机噬菌体展示肽库，以SARS恢复期病人IgG Fab段及正常人IgG Fab段为筛选靶标，经改良的生物淘洗方式，结合生物信息学方法，筛选SARS-CoV特异性B细胞优势表位；人工合成表位多抗原肽(MAPs)，ELISA法检测其特异性和敏感性；以表位肽免疫BALB／c小鼠，ELISA法检测抗体效价和特异性，研究表位肽诱导的特异性体液免疫应答；经淋巴细胞增殖试验、ELISPOT分析IL-4和IFN-γ分泌细胞数目变化、流式细胞技术分析脾淋巴细胞亚群变化和表位肽诱导CD4<+>T细胞产生的免疫记忆来研究表位肽诱导的特异性细胞免疫应答；经吞噬功能的检测研究表位肽诱导的非特异性免疫应答；通过ELISA法和噬菌体滴度测定观察表位介导的吸附作用以及特异性抗体对吸附的阻断作用。 结果： 1．经过2次4轮改良的生物淘洗，共筛选到9个SARS-CoVS蛋白表位和2个M蛋白表位。 2．经生物信息学分析，其中的7个表位即S91-102、S424-435、S458-469、S785-796、 S1065-1076、M148-159、M165-176分别为SARS-CoVS和M蛋白B细胞优势表位。合 成6个表位MAP肽(MAPl—MAP6，分别为S91-102、S424-435、S458-469、 S1065-1076、M148-159和M165-176)作进一步研究。竞争抑制试验结果显示各表位 肽均可抑制相应的噬菌体克隆与SARS恢复期病人IgG Fab段结合，最大抑制率为54 ％～86％，表明这些表位肽与其相应的噬菌体克隆可不同程度地竞争结合抗 SARS-CoVIgG Fab段的同一位点，证实了与抗SARS-CoVIgG Fab段结合的表位肽的 位点为SARS-CoyB细胞表位。 3．免疫学特性研究： (1)表位肽均能与SARS病人血清发生特异性反应，不与正常人血清、抗人冠状病毒 OC43(HCoV-OC43)血清和229E(HCoV-229E)血清发生交叉反应，具有SARS-(Coy特异性。与SARS病人血清反应时，表位肽S458-469，S91-102，S1065-1076和M148-159具有较高的敏感性。 (2) 表位肽诱导的特异性体液免疫应答：这些表位肽均能刺激小鼠产生高效价 (1∶1280～1∶5120)特异性抗体，MAP1、MAP2、MAP4这3个S蛋白表位肽诱导产生的抗体效价高于M蛋白表位肽诱导者。这些抗体能特异地与SARS-CoV灭 活抗原反应而不与HCoV-OC43和HCoV-229E抗原反应。 (3)表位肽诱导的特异性细胞免疫应答： ①免疫第14天，小鼠脾脏B淋巴细胞明显增生，T淋巴细胞相对减少，导致T／B比值明显下降。随T细胞增殖，T／B比值逐渐回复(除MAP2组)。发现MAP2免疫能引起短暂的T8细胞抑制，导致T4／T8比值明显高于对照组，并于第21天恢复正常，其余多肽免疫组T4／T8与对照组相比无明显差异，提示脾淋巴系统处于相对免疫 稳态。 ②首次免疫后8周，小鼠CD4<+>T细胞出现CD44CD62L的记忆细胞表型，再次接 触相同抗原，MAP3免疫组CD4<+>T细胞CD44表达轻微上调，其余组均轻微下调，随后处于高表达状态；CD62L表达连续上调，提示CD4<+>T细胞免疫记忆形成。 ③各表位肽均可刺激淋巴细胞不同程度增生，最大刺激指数22.0％～47.6％。S蛋白表位肽刺激淋巴细胞增生的程度大于M蛋白表位肽刺激者。 ④各表位肽均能刺激IL-4和IFN-γ分泌细胞增多，峰值分别为56～124个/2×10<5>个淋巴细胞和14～20个/2×10<5>个淋巴细胞，前者明显多于后者。S蛋白表位肽刺激IL-4分泌细胞多于M蛋白表位肽刺激者。 (4)表位肽诱导的非特异性免疫应答：各表位肽均能增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。 (5)展示SARS-CoVS91-102、S424-435和S458-469表位的噬菌体可不同程度地吸附Vero，Vero-E6，MDCK，Hep-2细胞，其特异性抗体可阻断表位介导的吸附作用。 结论：本研究以SARS恢复期病人血清为筛选材料，应用噬菌体展示肽技术，通过改良的生物淘洗方法，筛选出9个SARS-CoVS蛋白表位和2个M蛋白表位，表明SARS-CoVS蛋白和M蛋白为SARS-CoV的重要抗原成分。结合生物信息学方法在筛得的11个表位中选择6个优势表位，以ELISA、ELISPOT、流式细胞技术等免疫学方法研究这些表位的免疫学特性，结论如下：各表位肽诱导的免疫应答以体液免疫为主，刺激小鼠机体产生高效价抗体，证实这些表位为B细胞表位；其中S蛋白表位肽诱导的特异性抗体效价高于M蛋白表位肽诱导者，提示它们在表位疫苗或疫苗研制中的潜在应用前景；所筛表位具有SARS-CoV特异性，其中S458-469、S91-102、S1065-1076和M148-159具有较高的敏感性，此外，抗表位肽抗体具有特异性，可通过制备高效价免疫血清或单克隆抗体(McAb)用于特异性诊断，提示了这些表位在研制特异性诊断试剂中的潜在应用价值；表位S91-102、S424-435和S458-469可介导噬菌体对SARS-CoV宿主细胞的吸附，其特异性抗体可阻断吸附作用，提示它们可能为研究保护性疫苗和抗病毒药物的潜在靶点。