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随着越来越多疾病的出现,甾体激素类药物已逐渐发展成我国医药领域的重要门类。众所周知,甾体激素是人体重要的信号分子,通过与特定的受体蛋白结合,来调控细胞正常的生理功能,一旦缺失,将引发机体功能失调紊乱。9α-羟基雄甾4-烯-3,17-二酮(9-OHAD)是一类重要的甾药前体,是获得各类甾体药物的重要前体,可通过微生物降解植物甾醇获得。然而,植物甾醇的疏水性和侧链降解酶催化过程的复杂性制约了9-OHAD的产量,本文利用分枝杆菌Mycobacterium sp.136(MS136)为出发菌种,通过基因工程手段对植物甾醇转运系统及侧链降解过程进行研究,同时研究菌种传代和发酵条件对植物甾醇转化的影响,实现菌体对植物甾醇的高效转化。植物甾醇进入菌体是主动运输的过程,需要能量和跨膜蛋白的协助。以能量和跨膜蛋白相关基因,连接载体pmv261,构建植物甾醇转运系统,电转化分枝杆菌MS136,获得关于甾醇转运相关的基因工程菌。对其转化能力分析,甾醇投料量13.2 g/L,转化86 h,基因mceG-yrbE4A-yrbE4B、RmceG-sup4A改造菌摇瓶发酵9-OHAD产量达到了6.02 g/L左右,比原始菌株提高了19%。结果表明,转运系统有效提高了菌体对植物甾醇的传质过程。分枝杆菌降解植物甾醇侧链生产9-OHAD是一个涉及20多种酶参与的多酶催化过程。通过查找甾体代谢基因簇中的各有关侧链降解的关键基因,构建了11株不同的基因工程菌。经发酵分析,基因Rj125-fad19、fad19过表达菌摇瓶发酵9-OHAD产量比原始菌株提高16%-18%。结果表明,过表达侧链降解的关键基因可以提高菌体对植物甾醇的转化能力。分枝杆菌发酵活化种子前需要进行传代,原始菌株经发酵实验证实传到四代时9-OHAD的产量达到最大,但是菌改造后属于第几代没有明确的说法,实验中,将改造菌传代3次,记为二、三、四代,并对其都进行了发酵转化,结果发现改造菌在传到第三代时,已经具备了最强的转化能力,而第四代相对于第三代没有明显的变化。