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米尔贝霉素具有广谱、高效的抗寄生虫活性,对宿主不良反应极低,是目前理想的驱虫、杀虫药物。其C5-肟米尔贝霉素的活性更高,并且杀虫谱更广,效果更好。而5-酮基米尔贝霉素由于其C5位酮基的化学性质比较活泼,很容易合成5-肟米尔贝素衍生物,是化学合成5-肟米尔贝霉素衍生物的最佳前体,因此研究从米尔贝霉素A3、A4到5-酮基米尔贝霉素A3、A4的生物合成途径具有重要的意义。冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)是本实验室发现的一株新的吸水链霉菌菌株,是米尔贝霉素(milbemycin)和冰城霉素(bingchengmycin)的重要产生菌。冰城链霉菌的代谢产物具有较好的杀虫活性和高效防治能力。接合转移作为基因转移工具已在多种链霉菌中成功应用,此方法既可以避开胞外核酸酶使DNA免遭降解,在一定程度上还可以克服宿主对外源DNA的限制性修饰提高转化效率。binF基因(C5-酮基还原酶基因)是在冰城链霉菌中负责编码催化大环内酯类抗生素C5位的酮基转化为羟基的还原酶基因,序列较保守。本研究通过分子生物学的方法对binF基因进行失活,从而获得产生C5-酮基米尔贝霉素的生产菌株。以冰城链霉菌226541为研究材料,进行了大肠杆菌-冰城链霉菌属间接合转移系统的实验,尝试了冰城链霉菌中binF基因的中断工作。为了进一步研究binF基因在冰城链霉菌226541中的功能,本研究利用生物信息学分析冰城链霉菌的基因组信息,确定binF基因位置及相邻序列,设计引物binF-L1、binF-L2和binF-R1、binF-R2,在冰城链霉菌226541总DNA中扩增binF基因的两翼序列,与pMD19-T Vector连接构建出质粒pBCl130,在两翼中间插入硫链丝菌素抗性基因(tsr)构建出质粒pBC810。然后利用HindⅢ和BamHI酶切两翼,与pKCl139连接构建中断质粒pBC3129,并用PCR和测序比对验证了中断质粒构建的正确性。将binF中断质粒pBC3129转入ET12567(pUZ8002)获得接合转移供体菌ET12567(pUZ8002/pBC3129),通过接合转移导入冰城链霉菌226541中,得到阳性接合子。对接合子进行抗生素稳定性和分子生物学筛选,最终得到binF基因中断菌株。冰城链霉菌226541与大肠杆菌ET12567(pUZ8002/pBC3129)的接合转移体系为：冰城链霉菌226541孢子28℃孵育30mmin,大肠杆菌OD600值为0.2,混合涂布于含有30mM MgCl2的MS培养基上,培养16h覆盖抗生素。