研究背景支气管哮喘是由多种细胞(嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病,并与气道高反应性相关。哮喘的发病机制极为复杂,迄今尚未阐明,目前普遍被接受的发病机制有以下几种：①气道慢性炎症学说；②Thl/Th2失衡理论；③机体免疫耐受功能缺陷学说；④调节性淋巴细胞学说,其内容主要包括：免疫系统中的CD4+Treg细胞、CD8+Treg细胞,Th17细胞等,通过调节淋巴细胞,发挥激活或抑制作用参与气道炎症。但是,近年来从临床观察和基础研究表明,现存的理论并不能完全解释哮喘的发病机制,哮喘的治疗仍面临许多难题。NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain-leucine-rich repeats containing pyrin domain3)炎症复合体是一种细胞质内的多蛋白聚合物,主要由核苷酸结合寡聚化结构域受体(NLRP3)、半胱氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)、凋亡相关点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)组成,是caspase-1活化所必需的平台,调控IL-1β、IL-18、IL-33等促炎细胞因子的修饰与活化,进而影响获得性免疫反应。NLRP3炎症复合体主要在巨噬细胞、中性粒细胞、上皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞中表达。其中,NLRP3是细胞胞浆内重要的模式识别受体,能感知胞内病原微生物及代谢物,起始炎症复合体的组装,是构成炎症复合体的核心部分。IL-1β、IL-18、IL-33属于IL-1家族,其中IL-1β名前炎症反应细胞因子,主要由单核巨噬分泌,具有刺激单核细胞及促进嗜酸性粒细胞脱颗粒作用。IL-1β可促进Th17细胞分化、维持Th17相关细胞因子的产生,也可促进嗜酸性粒细胞的募集。IL-18则能促进T细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞分泌IL-4、IL-13,同时增强Thl介导的免疫应答。Harada等研究发现IL-18基因多样性与哮喘的恶化程度密切相关。IL-33可以促进Th2介导的应答,而Thl、Th2、Th17应答及嗜酸性细胞的募集,在支气管哮喘中发挥重要作用。近来国外文章相继报导了NLRP3炎症复合体与哮喘的关系,但作用机制到底如何目前尚没有定论。我们通过卵蛋白诱导哮喘小鼠模型,观察哮喘小鼠肺组织中NLRP3及其下游因子IL-18、IL-1β在肺组织中的表达及使用NLRP3炎症复合体抑制剂格列本脲后对哮喘气道炎症的影响,并分别对1L-1β、IL-18与肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞百分比(EOS%)进行相关性分析,以探讨NLRP3/IL-1β、IL-18通路在哮喘发病机制中的作用。第一部分哮喘动物模型的建立及验证目的：建立卵蛋白(OVA)致敏和激发的C57BL/6哮喘小鼠模型方法：6周龄雌性C57BL/6小鼠21只,体重18-20g,由南方医科大学实验动物中心提供,按随机数字表法随机分为3组,每组7只,分别为：正常对照(A)组、NLRP3炎症复合体抑制剂格列本脲(B)组和哮喘(C)组,每组7只。B组和C组于实验第0天、7天、14天分别腹腔注射OVA及明矾缓悬液共0.2ml致敏,第21天～27天连续雾化吸入1%OVA40ml激发,每次30min,1次/d;B组每次雾化激发前30min腹腔注射格列本脲500mg/kg;A组用生理盐水替代OVA致敏和激发。末次激发24h后,各组小鼠雾化吸入乙酰甲胆碱300μl,依次由低浓度开始激发0、3.125、6.25、12.5、25、50g/L,各浓度雾化后用BUXCO无创肺功能检测仪检测3min,记录气道反应性指标增强呼气间歇(Penh)值。Penh值=(呼气峰流速/吸气峰流速)×呼气间歇；Penh值越高,气道反应性就越高。各组小鼠最后1次激发30h后,摘右侧眼球取血。小鼠仰卧固定,开胸,分离暴露小鼠气管,用22号留置针行小鼠气管插管,冷PBS0.3mlX3进行肺泡灌洗,回收率在60%以上。肺泡灌洗液4℃1500r/min离心5min,取细胞沉渣进行细胞计数；而后瑞特-吉姆萨染色,对嗜酸性粒细胞、淋巴细胞计数。取右上肺组织,4%多聚甲醛固定24h后,酒精脱水,石蜡包埋,切片,苏木素-伊红(HE)染色。统计学分析：采用SPSS16.0统计软件分析数据。实验结果以均数±标准差(x±s)表示,多个样本均数比较采用单因素方差分析,方差齐时采用Bonferroni法进行多重比较,方差不齐是采用Welch法进行分析,Dunnett’3进行多重比较,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.致敏及激发过程中小鼠行为学观察：哮喘组、格列本脲组在第二次致敏10min后出现不同程度的呼吸急促,立毛,趴在原地,活跃明显减低,整个过程持续约3个小时,对照组未为出现上述表现。β、C组小鼠在雾化激发后出现不同程度的头面部瘙痒、前肢搔鼻、烦躁不安、口唇紫绀,而A组无明显上述症状。2哮喘小鼠气道反应性观察：从乙酰甲胆碱浓度为12.5g/Z开始,哮喘组Penh值高于正常对照(P<0.05)；在乙酰甲胆碱浓度为50g/Z时,格列本脲组的Penh值高于对照组,差异有统计学意义(P(0.05)；在所激发浓度下,哮喘组和格列本脲组之间,差异无统计学意义。3.哮喘小鼠BALF中白细胞计数改变：哮喘组BALF中白细胞总数、嗜酸粒细胞百分比、淋巴细胞百分比分别为[(29.88±4.97)×1o4/ml,(21.67±4.83)%,(31.87±5.31)%]均明显高于格列本脲组[(17.30±1.19)×104／ml,(12.45±1.12)%,(17.16±0.97)%,P<0.05]及对照组[(9.74±2.88)×1o4/ml,(1.15±0.26)%,(10.66±1.83)%,P<O.05],而格列本脲组比对照组高(P<0.05)。4.哮喘小鼠病理组织学观察：对照组小鼠肺组织支气管和肺泡结构完整,基本无炎症细胞浸润；哮喘组、格列本脲组肺泡间隔部分断裂,支气管壁周围较多炎症细胞浸润,多为淋巴细胞,格列本脲组炎症较哮喘组减轻。结论：根据不同组小鼠的气道反应性结果、肺泡灌洗液细胞总数及细胞分类计数结果、肺组织病理结果,证明0VA致敏和激发的C57BL/6哮喘小鼠模型建立成功。哮喘小鼠经格列本脲干预后气道炎症有所减轻。第二部分：NLRP3/IL-1β和IL-18在哮喘小鼠肺组织中表达及与气道炎症关系目地：探讨NLRP3/IL-1β和IL-18在哮喘小鼠肺组织中的表达及与气道炎症的关系方法：6周龄雌性C57BL/6小鼠21只,体重18-20g,由南方医科大学实验动物中心提供,按随机数字表法随机分为3组,每组7只,分别为：正常对照(A)组、NLRP3炎症复合体抑制剂格列本脲(B)组和哮喘(C)组,每组7只。哮喘模型的制作方法及过程同第一部分内容。造模后检测小鼠气道反应性、苏木精-伊红(HE)染色观察小鼠肺组织病理改变及计数支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数及嗜酸细胞百分比、淋巴细胞百分比以了解各组小鼠的气道炎症程度。Western blot检测肺组织NLRP3表达：取肺组织100mg,用冰冻的PBS液冲洗1遍,滤纸吸干,剪刀剪碎后,加入预冷的裂解液lml,冰磨3min,至不见组织碎块,离心取上清,-80℃冻存。采用BCA法测定蛋白含量。使用前各组蛋白分别取50μg, SDS-PAGE电泳和免疫印记反应,半干法转膜,最后用ECL发光剂荧光显色,在成像系统曝光观察蛋白条带,并用ImageJ software分析条带灰度值。RT-PCR检测肺组织NLRP3mRNA表达：提取总小鼠肺总RNA,逆转录为cDNA,以1μL cDNA为模板行PCR扩增,实时定量PCR样品反应体系采用SYBRGreen I,其最终的反应体系为25uL。循环条件为：95℃10min,<95℃10s,60℃30s,40℃5s进行45个循环。得到各自的荧光域值循环数(Ct值)后,采用相对定量法2-ΔΔCT进行计算。ELISA方法检测小鼠肺组织匀浆上清IL-1β、IL-18表达：取余右肺组织,预冷的PBS冲洗后滤纸吸干,称重,剪刀剪碎后,加入PBS液,冰磨2min至不见组织碎块离心取上清,BCA法测定蛋白含量,-80℃冻存。临用前参照试剂盒说明书进行IL-1β、IL-18的检测。并分别对IL-1β、IL-18与BALF中嗜酸性粒细胞百分比进行相关性分析。结果：1.哮喘小鼠肺组织中NLRP3蛋白的表达结果：Western Blot检测哮喘组肺组织NLRP3蛋白的表达均高于格列本脲组、对照组(均P<0.05)：而格列本脲与对照组之间差异没有统计学意义(P>0.05)。2.哮喘小鼠肺组织NLRP3mRNA的表达统计结果：RT-PCR检测哮喘组肺组织的NLRP3mRNA表达均高于格列本脲组、对照组(均P<0.05),差异有统计学意义：而格列本脲组与对照组差异没有统计学意义(P)O.05)。3.哮喘小鼠肺组织中IL-1β和IL-18的变化：哮喘组肺组织匀浆上清IL-1β(74.81±17.45)pg/mg及IL-18(426.94±76.05)pg/mg含量均高于对照组[(37.54±5.53)pg/mg,p<0.05；(249.62±161.20)pg/mg,P<0.05],而格列本脲组与其他两组相比差异没有统计学意义(P)0.05)。4.IL-1β、IL-18与嗜酸性粒细胞百分比呈正相关(r=0.833,P=-0.02；r=0.856,P=-0.014)。结论：NLRP3及其下游因子IL-1β、IL-18在哮喘小鼠肺组织中高表达,采用NLRP3抑制剂格列本脲进行干预后哮喘小鼠气道炎症减轻,且IL-1β、IL-18与肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞百分比呈正相关,提示NLRP3/IL-1β、IL-18通路可能在气道炎症的形成中发挥着重要作用。