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目的 毒蕈碱乙酰胆碱受体（mAChRs）是鸟核苷酸结合蛋白（G-蛋白）偶联受体（GPCRs）超家族的成员，具有该家族特征性的分子结构和跨膜信号转导方式。GPCRs通过兴奋偶联的G-蛋白，促使GTP替换GDP，Gα-GDPβγ异三聚体解离成Gα-GTP和Gβγ亚单位，活化G-蛋白。由mAChRs参与的跨膜信号转导系统同样由受体、G-蛋白和效应蛋白（effector）构成。m1、m3和m5亚型与G-蛋白中的Cqα或G0α偶联，激活下游的效应蛋白-磷脂酶C（PLC）；m2和m4亚型与Giα偶联，抑制腺苷酸环化酶（AC）的活性。GPCRs与G-蛋白的融合蛋白表达系统具有如下优点而适用于多种GPCRs的研究，即融合蛋白使信号转导分子间具有精确的1：1化学定量关系及相互彼邻的空间位置，并使Gα紧紧锚定在细胞膜上。由于该融合蛋白具有高效偶联、不受内源性G-蛋白影响的特点，为融合蛋白配体结合功能和信号转导机制及影响因素的研究奠定了分子基础。本研究采用分子生物学技术，利用Baculovirus-insect-cell（Sf9 cells）系统构建和表达m4AChR-Gilα融合蛋白，检测在配体的作用下，m4AChR-Gilα融合蛋白的功能及信号转导时分子间相互作用的机制和影响因素。寻找m4AChR亚型特异性新药，从而有助于解决由于缺乏特异性配体导致的m受体药理学分型落后于分子生物学分型的问题，并为开发和研究有临床价值的M受体亚型特异性新药奠定基础。 材料与方法 1．实验材料 人m4 AChR与牛Gilα的cDNAs，杆状病毒（baculovirus）载体质粒pBacPAK9的cDNAs；Sf9昆虫细胞株；IPL-41昆虫培养基；胎牛血清；[3H]QNB与[35S]GTPγS。 2．实验方法 本实验应用PCR技术，将m4受体胞内羧基端与G-蛋白Gilα的氨基端eDNAs重组，插人到PBaepAKg病毒载体中，利用Baeulovirus一inseet一eell（Sfgeells）系统表达单独m4 AehR蛋白和m4 AehR一Gila融合蛋白。通过〔’H」QNB放射配体结合实验检测受体表达水平及与配体结合功能;通过仁”S〕GTp，S的替代结合实验，检测激动剂或拮抗剂在不同浓度GDP、GTp、ATP和Na‘和K‘存在时，对〔”5] GTp，S替代结合作用的影响。结果 1·pBacPAKg一叭AChR一Gi城。DNAs表达载体的建立 通过两次PCR技术成功地建立了pBacPAKg一叭AChR一Gila的cDNAs表达载体，DNA序列分析结果表明杆状病毒载体质粒pBacPAKg中的目的DNAs确是m4AChR一Gila融合eDNAs。 2.叭AChR一Gila融合蛋白的表达 镜下可见转染表达pBacPAKg一m4 AChR一GilacDNAs载体病毒的Sfg昆虫细胞肿胀变大，边界不清，颗粒增多的病毒转染状态。该结果说明通过Sfg昆虫细胞成功表达了m4 AChR一Gila融合蛋白。 3.m4AChR蛋白和m4AChR一Gila融合蛋白的表达水平 Tablel显示Sfg细胞内表达的m4 AChR蛋白及m4 AChR一Gila融合蛋白的〔’H〕QNB结合位点分别是41 .91士3.06 pmol·mg一，膜蛋白和47.04士1.58 pmol·mg一，膜蛋白。 4.GTP下S对〔’H〕QNB与m4AChR一Gila融合蛋白结合的竞争性抑制作用 Fig.IA和B显示随着〔’H」QNB浓度的升高，m4AChR蛋白及m4AchR-Gila融合蛋白与〔’H〕QNB的结合量均增加，在[’H〕QNB浓度为10 nmmol·L，时结合量基本达到饱和，说明两种膜蛋白都具有m受体的结合特性。在10协mmol·L一‘GTP下S存在时，m4 AChR一Gila融合蛋白与[’H〕QNB结合饱和曲线明显下移，而m4 AChR蛋白结合饱和曲线移动变化不明显，提示GTP，S可抑制[’H」QNB与m4 AChR一Gila融合蛋白的结合，说明m4 AehR-Gila融合蛋白两组分间具备相互偶联效应，且改变m4 AChR一Gila融合蛋白分子中m4 AChR的空间结构。 5.〔”S]GTP移放射配体替代结合实验 Fig.2显示在GDp零浓度时，乙酞胆碱（aeetyleholine，ACh）使叭AChR一Gila与[”S〕GTp，s结合量最大，卡巴胆碱（eatha哪leholine，CCh）次之，prifinium和阿托品（atroPine，Atro）较小，且明显高于同等条件下叭AChR与[’55〕G即丫S的结合量;而在ACh、CCh、prifinium和Atro四种配体作用时，m4 AChR与〔”S」“P，S的结合量无明显差异。Fig.3也显示叭AChR一Gila与[”S〕留P，s结合量高于叭AChR的现象。Aeh使m4 AehR-Gila与〔”s」GTp，s结合曲线位置最高，cch次之，prifiniuln较低，Atro最低。但在同等条件下，ACh、CCh、prifinium和阿托品使m4 AehR与[’55〕GT巧S替代结合曲线均明显低于m4 AChR一Gila，且相互间有明显差异。结果说明m4 AChR一Gila融合蛋白两组分间存在相互作用的特性，可用于分析m4 AChR与GIIa间偶联作用和作用机制的研究。也提示ACh、CCh，prifini-um和Atro可以使m4 AChR一Gila融合蛋白分子中的Gila活化，并使叭AChR一Gila融合蛋白中的Gila产生不同活性，可用于区别m;AChR亚型特异性配体的性质。 6.在完全激动剂、部分激动剂及拮抗剂作用下，GDP、GTp或ATP对[”sjGTP移替代结合曲线的影响 Fig.4所示为10一，o一10一mmol·L.，GDp存在时，10并mmol·L一‘ACh，z04mmol·L一，CCh，10礴nunol·L一1 AF一loZB，zo4mmol·L一，P五且nium，10礴