细胞自噬是细胞内重要的降解途径之一,细胞中双层膜结构包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体(autophagosome),然后与溶酶体(lysosome)融合形成自噬溶酶体(autophagolysosome),降解其所包裹的内容物,产生氨基酸等生物小分子,并被细胞重新利用,以实现细胞器的更新和细胞稳态。自噬在应对细胞饥饿,维持细胞质量、能量平衡,抑制肿瘤发生,调控机体免疫等过程中都发挥着重要的功能。近年来在小鼠中,许多自噬相关基因系统性和组织特异性敲除实验证明了自噬对胚胎着床前的发育、胚胎发生到新生个体的存活都必不可少。越来越多的研究结果表明自噬参与肝脏中的物质代谢,也在许多肝脏疾病包括脂肪肝和肝癌的发生都发挥着重要的作用。Beclin1基因也称BECN1基因,是酵母自噬相关基因ATG6的哺乳动物同源基因,该基因位于人染色体17q21,具有12个外显子,并且广泛表达于人类正常组织,是哺乳动物自噬发生的必需基因。Beclin1蛋白结构与其功能在多种物种中都高度保守,Beclin1蛋白有四个重要的结构域:BH3(Bcl-2 homolog 3)结构域、卷曲螺旋结构域(coiled-coil domain/CCD)、进化保守结构域(evolutionarily conserved domain/ECD)和一个核输出结构域(NES),Beclin1通过这些结构域招募其它多个自噬相关蛋白并定位于吞噬泡,形成多蛋白复合体,以此来调控哺乳动物自噬小体的形成与成熟。斑马鱼(Danio rerio)是一种亚热带小型鱼类,具有鱼体小、易于饲养、发育快速、性成熟期短、体外受精、胚胎体外发育并且透明,再生能力强等特点,是研究器官发育与再生的常用模式动物。人们发现许多自噬相关基因如atg1,atg3,atg4,atg5,becn1,atg7,atg9,ambra1,atg12,atg14和atg16在斑马鱼中都存在同源基因,其蛋白结构与人类高度相似,而斑马鱼的优点也使其成为研究自噬功能和机制的良好模式生物。近年来一些工作利用MOs在斑马鱼中研究自噬,希望能揭示自噬在斑马鱼发育和器官再生中的作用,以及探究自噬在病菌感染防御,细胞先天性免疫和获得性免疫中的作用。2012年以来TALEN和CRISPR/Cas9基因敲除技术在斑马鱼中成功的运用,极大地丰富了斑马鱼的研究手段和研究领域,也成为斑马鱼中研究自噬的有力工具。本研究利用CRISPR/Cas9技术在斑马鱼中敲除自噬相关基因becn1,构建突变体,用来探究becn1在斑马鱼胚胎发育中的功能,特别是对斑马鱼肝脏发育及功能的影响。我们运用CRISPR/Cas9技术在斑马鱼中成功地敲除了becn1基因,获得了稳定遗传的突变体。6dpf之前,becn1突变体形态发育与野生型没有明显区别,这表明becn1对斑马鱼胚胎期的发育可能不是必需的,尽管不能排除突变对特定细胞分化和生理环境存在影响。在7~8dpf时,becn1突变体肝脏明显肿大,比野生型大1.5~2倍左右,pH3免疫染色实验表明肝脏细胞大量增殖。突变体肝脏中P62蛋白,泛素化蛋白以及蛋白聚集体大量增加,线粒体特异性标记物Cox4i1蛋白水平也明显升高,说明细胞中自噬的形成被阻断,导致蛋白聚集体和线粒体积累。Western blot的结果表明becn1突变体中内质网应激的相关蛋白Chop,Bip,p-Eif2都明显增加,并导致内质网应激。在9~10dpf,becn1突变体死亡。同时,我们也利用CRISPR/Cas9技术在斑马鱼中成功地构建了自噬相关基因atg7和atg5的突变体,初步的结果表明这些突变体的胚胎发育基本正常,但是在出生后13dpf到26dpf都基本死亡,其死亡原因以及死亡前组织细胞以及器官的变化还需进一步研究。本研究通过CRISPR/Cas9技术在斑马鱼中成功构建了三个自噬相关基因becn1,atg5和atg7稳定遗传的突变体,由于斑马鱼体外受精,发育快速的特点,避免了哺乳动物中系统性敲除这些基因导致胚胎发育早期或出生不久便死亡的结果,为进一步研究自噬在发育、维持细胞分化、细胞生理功能以及对肿瘤发生影响提供了良好的实验动物模型。