【摘 要】
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果聚糖蔗糖酶是一类属于糖苷酶68家族的糖基转移酶,能够以蔗糖为底物发生催化反应。基于受体的不同,可以发生水解、聚合和转糖基反应,特别是利用该酶的转糖基性能催化制备功能性低聚糖,已成为糖工程领域的研究热点,在食品、制药、农业等领域有着广阔的市场前景。本课题对来自于Bacillus subtilis的果聚糖蔗糖酶（LRS）基因与载体p ET-28a（+）进行重组,并转入E.coli BL21（DE3）
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果聚糖蔗糖酶是一类属于糖苷酶68家族的糖基转移酶,能够以蔗糖为底物发生催化反应。基于受体的不同,可以发生水解、聚合和转糖基反应,特别是利用该酶的转糖基性能催化制备功能性低聚糖,已成为糖工程领域的研究热点,在食品、制药、农业等领域有着广阔的市场前景。本课题对来自于Bacillus subtilis的果聚糖蔗糖酶（LRS）基因与载体p ET-28a（+）进行重组,并转入E.coli BL21（DE3）中高效表达,获得基因工程菌E.coli BL21（DE3）/p ET-28a（+）-LRS。本文主要从以下方面对LRS进行探究:包括LRS的基因克隆表达、酶学性质以及LRS的转糖基性能及其催化产物生物活性评价等。LRS酶学性质结果表明,最适温度为50℃,在50℃下孵育90 min,酶活力仍为原始酶活的88%;最适p H为5.5,在p H为6.0时孵育24 h,酶活力是原始酶活力的95%,说明该酶有较好的稳定性。Mn2+和Ca2+对酶活力促进作用明显,Cu2+和SDS对酶活有抑制作用。在以蔗糖为底物时,Km和Vmax值分别为22.06 mmol/L和6.4μmol/（L·s）,表明该酶对蔗糖有较好的亲和力。以蔗糖为底物催化制备分子量均一的β-（2,6）糖苷键的果聚糖时,蔗糖转化率可达63.56%。LRS具有转糖基功能,利用转糖基性能合成功能性低聚糖意义重大。确定了以乳糖为糖基受体,通过HPLC、MS、NMR等表征产物结构。并对催化工艺进行优化,确定最佳合成条件为300 m M蔗糖和300 m M乳糖,35℃下,p H为6.0时,酶浓度为5 U/m L,反应12 h,乳果三糖的最终产量为182 m M。评价乳果三糖能否促进益生菌增殖、有无细胞毒性、抗炎活性等生理功能,发酵实验结果表明,乳果三糖可以显著促进双歧杆菌、乳杆菌增殖及产酸,且增殖与产酸能力均强于低聚半乳糖和乳果糖,并且通过气相色谱测定发酵液中短链脂肪酸含量,发现乳酸和乙酸含量较高,有利于肠道代谢。MTT实验结果表明,当乳果三糖浓度小于25 mg/m L时,对细胞几乎没有毒性。脂多糖诱导细胞炎症模型发现,当乳果三糖的浓度为10 mg/m L时,可显著下调促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-αm RNA的表达,具有较为明显的抗炎作用。本研究通过果聚糖蔗糖酶的转糖基功能合成功能性低聚糖,为果聚糖蔗糖酶更好地应用于生产提供基础,同时为单一聚合度低聚糖的制备提供参考。
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