表皮干细胞或毛囊干细胞是指存在于表皮基底层和毛囊外根鞘上的干细胞,目前对于这两个概念还没有明确的区分,对于这些干细胞的研究主要集中在对有毛发皮肤的研究,尤其集中在对有毛发皮肤中毛囊外根鞘上干细胞的研究,而对于无毛发皮肤上的这些干细胞的研究仍鲜有文献报道。用于标记这些干细胞的标记物很多,最常用的标记物是CK15和CD29,其中CK15的标记干细胞的特异性高于CD29。这些干细胞在不同类型皮肤中的分布特点不同,在创面愈合中发挥着重要的作用,由于不同类型的皮肤干细胞的含量和分布不同,故不同类型皮肤的创面愈合能力也不同。本实验研究用CK15、CD29标记阳性的这些干细胞在不同类型皮肤的分布特点以及将不同类型的皮肤(有毛发皮肤和无毛发皮肤)用于创面,以探讨有毛发皮肤的毛囊外根鞘、表皮基底层和无毛发皮肤的表皮基底层的CK15、CD29阳性细胞对创面愈合的影响。第一部分:CK15、CD29阳性细胞在人体不同类型皮肤的分布研究目的:研究CK15、CD29阳性细胞所代表的存在于表皮基底层和毛囊上的干细胞在人体不同类型皮肤的分布特点。方法:根据大体观察,选取四种人体皮肤明显不同的部位即:①头皮有毛组②躯体纤毛组③包皮无毛组④脚掌无毛组。标本来自10—30岁正常皮肤,性别不限,大小1.0×1.0cm~2,每组6个标本,标本石蜡包埋切片,每组选质量较好的三张白片,分别行HE染色、CK15和CD29免疫组化染色。在低倍镜和高倍镜下观察,CK15和CD29免疫组化染色的片子200倍镜下随机选取3个有效视野计算机采图并拍摄,并用Image—Pro Plus图象分析软件分析,计算每张图片的Pu值(PU值的大小代表了每张图片阳性细胞数的多少),并进行统计学分析,结果用KruskalWallis H检验,秩转换F检验以及秩转换LSD—t两两均数比较分析。结果:大体观察结果提示,头皮有毛组毛囊密集、粗大,毛干粗长,皮肤全层厚;躯体纤毛组毛囊稀疏、细小,毛干细短,皮肤全层较厚;包皮和脚掌无毛组无毛囊结构,包皮皮肤薄;脚掌皮肤较厚。HE染色结果提示,头皮有毛组表皮钉突粗大而少,毛囊粗长密集;躯体纤毛组表皮钉突细小而多,毛囊细短稀疏;头皮有毛组和躯体纤毛组的皮脂腺都位于毛囊周围,其开口位于毛囊上三分之一的底部;包皮和脚掌无毛组无毛囊结构,包皮无毛组表皮钉突少,皮脂腺大而多;脚掌无毛组表皮钉突较多,皮脂腺少。CK15免疫染色结果提示,头皮有毛组阳性细胞主要集中在毛囊隆突部,毛囊与毛囊之间的表皮基底层几乎无染色;躯体纤毛组阳性细胞集中在表皮基底层,其中表皮钉突部位明显比紧挨真皮乳头的表皮基底层染色深,零星散在的毛囊结构上也有阳性细胞染色;包皮无毛组阳性细胞集中在表皮基底层;脚掌无毛组表皮基底层几乎未见阳性细胞。CD29染色结果提示,头皮有毛组阳性细胞也主要集中在毛囊隆突部,与CK15基本相同,但毛囊与毛囊之间的表皮基底层也有明显染色,另外皮脂腺基底细胞也有阳性细胞;躯体有毛组除了皮脂腺基底细胞有阳性细胞外,其余部位染色与CK15相似;同样包皮无毛组除皮脂腺基底细胞有阳性细胞外,其余部位染色也与CK15相似;脚掌无毛组基底层的阳性细胞染色较CK15明显,另外皮脂腺基底细胞中可见阳性细胞。统计学分析CK15、CD29两种染色结果较一致,表现为头皮有毛组和包皮无毛组PU值最大,即所含阳性细胞数最多,躯体纤毛组其次,脚掌无毛组PU值最小,所含阳性细胞数最少。KruskalWallis H检验,秩转换F检验P＜0.01,秩转换LSD—t两两均数比较显示脚掌无毛组与各组的P＜0.01,其他各组间的P＞0.05。结论:CK15、CD29标记的皮肤干细胞在不同类型的皮肤分布不同:即在头皮皮肤主要位于毛囊隆突部;在躯体皮肤主要位于表皮基底层钉突部位;包皮皮肤和脚掌皮肤主要存在于表皮基底层。另外在CD29染色中,存在于头皮皮肤毛囊与毛囊之间表皮基底层和各类型皮肤的皮脂腺基底层中的阳性细胞可能主要是由表皮分化而来的短暂增殖细胞。不同类型的皮肤所含的干细胞在数量上也明显不同,表现为头皮和包皮皮肤所含干细胞最丰富,躯体皮肤其次,脚掌皮肤含量最少。第二部分CK15、CD29阳性细胞在大鼠不同类型皮肤的分布研究目的:研究CK15、CD29阳性细胞在大鼠不同类型皮肤的分布特点。方法:实验大鼠为SD大鼠,根据大体观察选取三个皮肤明显不同的部位即:①大鼠鼠须皮肤②大鼠躯体皮肤③大鼠脚掌皮肤。标本石蜡包埋切片,选取连续切片较好的三张片子,分别做HE染色、CK15和CD29免疫组化染色。低倍和高倍镜下镜检,用第一部分实验的统计方法对CK15和CD29免疫组化染色阳性细胞进行定量统计学分析。结果:大体观察鼠须皮肤厚,毛囊粗大稀疏,毛干长而粗,毛囊较易分离;躯体皮肤较薄,毛囊细小密集,毛干短细,毛囊较难分离;脚掌皮肤最薄,无毛发结构。HE染色观察提示,鼠须皮肤毛囊与毛囊之间的表皮除角质层外只有一层基底细胞,细胞排列整齐,无类似于人类皮肤的颗粒层和棘层;躯体皮肤表皮在角质层和基底层之间散在存在棘细胞和颗粒细胞,但层次不完整;脚掌表皮基底层、棘细胞层、颗粒细胞层和角质层结构完整。CK15和CD29染色提示,鼠须皮肤和躯体皮肤阳性细胞集中在毛囊下二分之一,其中毛囊外根鞘和毛球部染色最明显,表皮基底层染色不明显,腺体基底层也可见阳性细胞;脚掌皮肤阳性细胞集中在表皮层内,除了基底层外,表皮其它层也存在零星的阳性细胞。对三组的阳性细胞定量分析结果无统计学意义(P＞0.05)。结论:CK15、CD29标记的大鼠皮肤干细胞在大鼠不同类型皮肤分布不同:在鼠须和躯体皮肤,皮肤干细胞主要集中于毛囊的下1/2的毛囊外根鞘和毛球部,这与人体有毛皮肤(头皮和躯体皮肤)的分布不同;脚掌无毛发皮肤中皮肤干细胞集中于表皮基底层,但在表皮其他层次也有零星分布,与人体无毛皮肤(脚掌和包皮皮肤)的干细胞分布也不同。第三部分含CK15、CD29阳性细胞的不同类型皮肤对大鼠创面愈合的影响目的:研究存在于有毛发皮肤的毛囊外根鞘、表皮基底层和无毛发皮肤的表皮基底层的CK15、CD29阳性细胞对大鼠创面愈合的影响。方法:选取易于分离的SD大鼠鼠须毛囊和无毛发的大鼠脚掌皮肤,将实验组分为①带表皮毛囊移植组②不带表皮毛囊移植组③脚掌皮肤移植组,其中不带表皮的毛囊定义为所分的单根毛囊切除毛囊上1/3,将脚掌皮肤剪成单根毛囊大小。每只SD大鼠背部两侧各做一个1.5×1.5cm~2的全层皮肤缺损创面,将这三种移植物分别移植于创面上,每个创面均为6个毛囊或6小块脚掌皮肤。创面打包固定,一周后拆除包扎,创面敞开。术后一周、二周、三周分别行创面的测量,观察并取各组各周的标本,石蜡包埋切片后。选取质量较好的连续三张切片,做HE染色和CK15、CD29免疫组化染色后镜检,用第一部分实验的统计方法对CK15和CD29免疫组化染色阳性细胞进行定量统计学分析。结果:大体观察提示,术后一周,三组毛囊和脚掌皮肤除个别在换药时被撕落,存活均较好,创面肉芽新鲜,新生表皮混于肉芽中较难分辨;术后二周,除脚掌皮肤组创面外,其余两组基本表皮化;术后三周,创面均完全表皮化,两组毛囊移植组的创面愈合明显较脚掌皮肤组平整。三组创面随观察时间延长均收缩明显,收缩程度无明显差异(P＞0.05)。HE染色观察提示,各组创面第一周都已表皮化,带表皮毛囊组和不带表皮毛囊组表皮愈合各处厚度明显较脚掌皮肤组均匀。在第三周各组都出现由表皮基底层细胞向疤痕组织中突入增生形成的腺体组织,两组毛囊移植组出现腺体样组织早(第二周),成熟早(第三周),带表皮毛囊移植组观察到的腺体组织最多,脚掌皮肤移植组只在第三周偶尔可观察到正在形成中的腺体组织。CK15和CD29免疫组化染色结果相似,即三组创面术后三周中新生表皮各层中均出现阳性细胞且肉芽组织中也有阳性细胞,另外在新形成成熟的腺体中也可见阳性细胞,对各组行KruskalWallis H检验结果差异不明显(P＞0.05)。结论:有毛发皮肤的毛囊对创面愈合的影响优于无毛发脚掌皮肤对创面愈合的影响。创面新生组织中腺体形成能力带表皮的毛囊移植的创面最强,不带表皮的毛囊移植创面其次,脚掌皮肤移植的创面最不易形成腺体组织,说明存在于有毛发皮肤毛囊上的干细胞其分化能力强于存在于无毛发脚掌表皮基底层的干细胞。各组创面中新生表皮中CK15、CD29标记的干细胞数量上无明显差异,说明不同类型皮肤移植物对创面新生表皮中出现的干细胞数量无明显影响。