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糖尿病是一种严重威胁人类健康的内分泌代谢性疾病,发病率呈逐年上升趋势。在糖尿病患者中,2型糖尿病占95%以上。2型糖尿病早期阶段以胰岛素抵抗为主,随着病程延长,胰岛β细胞功能逐渐减退,胰岛素分泌减少,造成2型糖尿病病情进一步恶化。目前2型糖尿病治疗药物主要以西药口服降糖药为主,但常伴有一些严重的不良反应,如低血糖、消化道反应等。由于胰岛β细胞在糖尿病病理学中重要的作用,所以从天然药物中寻找和开发具有保护胰岛细胞功能的生物活性物质意义重大。因此,本文考察了人参皂苷Compound K(CK)的降血糖作用,并探讨了其发挥保护胰岛细胞损伤作用的机制。CK是人参二醇型皂苷肠内菌代谢产物,被证明是在体内真正发挥药理活性的物质。近来,研究表明CK具有显著的抗糖尿病活性,但是它对胰岛功能的作用报道较少。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一种重要的蛋白激酶,是真核生物的重要的“细胞能量调节器”。它在2型糖尿病的多个环节,包括胰岛素分泌、胰岛细胞损伤、糖原合成、糖异生等多方面发挥着调节作用,现已成为2型糖尿病治疗的新靶点,而且研究表明,在体外激活AMPK可以诱导胰岛β细胞凋亡。本研究中,采用人参二醇组皂苷Rd转化制备CK,然后采用高脂饮食联合STZ建立的小鼠2型糖尿病模型和MIN6胰岛细胞考察CK对胰岛细胞损伤的保护作用以及AMPK蛋白在CK抗糖尿病活性中的作用,本研究共分为两大部分:第一部分,利用蜗牛酶在优化的条件下将人参二醇组皂苷Rd转化为CK,HPLC分析其纯度在98%以上,满足实验要求。采用高脂饮食联合一次性腹腔注射STZ(100mg/kg)诱导小鼠2型糖尿病模型,考察CK的降糖作用,结果表明,与模型组相比,CK(30mg/kg)治疗四周后,空腹血糖显著下降,血清胰岛素水平明显升高,胰岛素敏感指数增加。OGTT实验显示CK明显降低曲线下面积,改善糖耐量异常,此外,CK同时显著下调模型组TG,TC水平。胰岛HE染色以及胰岛素免疫组化结果显示,CK治疗组的小鼠胰岛损伤程度较轻,平均胰岛素染色阳性区域面积增加。胰岛TUNEL染色结果显示,模型组细胞凋亡率为54±7%,而正常组和CK组的细胞凋亡率分别为10.2±5%,39±8%。Westernblot结果显示,CK抑制了模型组胰腺组织AMPK,JNK以及线粒体凋亡途径相关蛋白(Bax/Bcl-2, Cytchrome-c, Csapase-3)的表达。第二部分,考察CK对棕榈酸以及过氧化氢在体外诱导小鼠MIN6细胞损伤模型的保护作用及其机制。检测指标及方法主要为:MTT法检测细胞活性,caspase-3活性试剂盒检测细胞caspase-3活性,Annexin V/PI双染试剂盒检测细胞凋亡,DCHF-DA活性氧试剂盒检测细胞内ROS水平,western blot检测细胞蛋白表达(AMPK,JNK,GLUT2),放免试剂盒检测葡萄糖刺激胰岛素分泌,HPLC检测细胞内ATP含量。棕榈酸模型结果表明,CK可以显著增加该模型细胞活性,下调caspase-3活性,减少细胞凋亡率。棕榈酸诱导AMPK,JNK磷酸化形式表达增加,而CK下调p-AMPK,p-JNK的表达,该作用被AMPK激动剂AICAR所抑制。过氧化氢损伤模型结果表明,CK同样可以增加该模型细胞活性,下调caspase-3活性,减少细胞凋亡率,减少ROS生成。最后,CK增加正常MIN6细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌,上调GLUT2蛋白,增加细胞内ATP含量。综上所述,得出以下结论:1、 CK可以改善2型糖尿病小鼠糖脂代谢紊乱,增加胰岛素分泌,减轻胰岛素抵抗。2、 CK可以通过AMPK-JNK-线粒体凋亡途径减少2型糖尿病小鼠胰岛细胞凋亡以及棕榈酸诱导的MIN6细胞凋亡。3、 CK在体外表现出抗氧化活性,可以通过减少ROS生成保护过氧化氢诱导的MIN6细胞凋亡。4、 CK可通过调节GLUT2蛋白,增加MIN6细胞胰岛素分泌。