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杆状病毒科包含一大类专一性感染昆虫的有囊膜病毒,它们的基因组是环状、超螺旋的双链DNA分子。目前已经在600多种昆虫中分离到杆状病毒,主要是鳞翅目、膜翅目和双翅目的昆虫。杆状病毒在其生活周期中,产生两种遗传物质相同,但是形态和功能完全不同的病毒粒子,即出芽型病毒(budded virus,BV)和包埋型病毒(occlusion-derived virus,ODV)。家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)只感染家蚕(Bombyx mori),是目前研究最广泛的杆状病毒之一。本研究以BmNPV四个功能未知的ODV相关蛋白ORF40、ORF133/134和ORF92a为研究对象,通过构建基因敲除突变体,发现它们在ODV的形成过程中发挥不同的功能。主要结果如下。1.BmNPV ORF40的功能研究BmNPV的ORF40(bm40)位于病毒基因组的38,254-39,213 nt,在己测序的a杆状病毒基因组中高度保守。bm40的开放阅读框(openreading frame,ORF)全长960 bp,编码319个氨基酸残基,预测分子量为37.8 kDa。生物信息学分析显示Bm40的N端和C端分别含有一个Dna J结构域和一段RNA识别基序(RNA recognition motif,RRM)。RT-PCR和免疫印迹结果表明bm40是一个晚期表达基因。利用λ Red同源重组系统构建了敲除bm40的重组病毒。结果表明,敲除型病毒只能感染单个细胞,无法产生具有感染力的子代BV病毒粒子,但是病毒DNA的复制没有受到影响。电镜结果表明,敲除bm40影响了核衣壳从细胞核转运到细胞质、核衣壳包膜形成ODV病毒粒子,以及随后ODV包埋的过程。共聚焦显微镜分析发现,从感染后48小时,Bm40主要位于细胞核内,并在感染晚期聚集在核膜和多角体上。敲除Bm40的RRM不影响BV的产生和Bm40的细胞内定位。以上结果表明,在BmNPV感染周期中,Bm40在BV的产生和ODV的包膜过程中发挥重要作用。2.BmNPV ORF133/134 的功能研究BmNPV的ORF133(bm133 和ORF134(bm134 分别位于病毒基因组的126,858-127,313 nt和127,342-127,671 nt。这两个开放阅读框相邻,并且转录方向相反。这两个基因在所有已测序的group INPV中高度保守,分别编码两种小分子蛋白(Bm133,17.7kDa;Bm134,12.4kDa)。RT-PCR 结果表明bm13 和bm134均是晚期表达基因。利用λRed同源重组系统构建了bm13 和bm134同时缺失的重组病毒。结果表明,同时敲除两个基因不影响BV的产生和病毒DNA的复制。电镜结果表明,双敲除不影响核衣壳的组装、核内微泡的形成,以及ODV病毒粒子的产生,但是被包埋进多角体的ODV病毒粒子数量显著减少。进一步研究显示单独修复某个基因并不能恢复ODV包埋的能力,表明这两个基因在ODV包埋过程中缺一不可。共聚焦显微镜分析发现,病毒感染期间Bm133和Bm134同时位于细胞质和细胞核。在裂解的细胞中,Bm134主要聚集在多角体上。这些结果表明,Bm133和Bm134不是BV和ODV产生必需的,但是它们在ODV包埋与多角体形态发生过程中发挥重要作用。3.BmNPV ORF92a的功能研究BmNPV的ORF92a(bm2a)位于病毒基因组的88,983-89,162 nt,在己测序的杆状病毒基因组中高度保守。bm92a的开放阅读框全长180 bp,编码59个氨基酸残基,预测分子量为7.1 kDa。Bm92a是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的经口 感染因子AC110的同源物,在其N端存在一段高度疏水的跨膜结构域(transmembrane,TM)。RT-PCR和免疫印迹结果表明bm92a是一个晚期表达基因。利用λRed同源重组系统构建了敲除bm92a的重组病毒。结果表明,bm92a敲除型病毒和修复型病毒具有类似的增长曲线。电镜结果表明,bm92a敲除不影响核衣壳的组装、ODV的包膜和多角体的形态。共聚焦显微镜分析发现,病毒感染期间Bm92a主要位于细胞核内的环形区域,并在感染晚期聚集在多角体上。并且,Bm92a的细胞内转运和定位模式与经口感染因子PIF1和PIF2的类似。酵母双杂交和双分子荧光互补实验发现Bm92a与PIF1具有强烈的互作关系。这些结果表明,Bm92a不是BV和ODV产生必需的,它可能通过与PIF1的互作参与经口感染因子复合体的形成。