背景:核酸（DNA和RNA）具有良好的生物相容性、可编程性和可寻址性。根据核酸纳米技术在结构定制能力上的显著优势,可以通过精确设计DNA得到几乎任何目标DNA结构。然而,功能性DNA的设计仍然是一项极具挑战性的任务,它需要我们深入了解DNA构象变化之间的关系,以响应不同条件下的特定功能变化。核酸适配体一般是长度为几十个碱基的单链寡核苷酸序列（DNA或RNA）,可通过自身的结构和空间构型与其他分子作用,能高亲和性和高特异性地与生物靶标（小分子、离子、蛋白、细胞）结合,被广泛应用于医学、生物、化学、材料等学科。核酸适配体一般通过指数富集配体系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）从随机寡核苷酸文库中筛选得到。然而,SELEX筛选过程周期长、成本高、效率低,很难从得到的序列中筛选出最佳的核酸适配体。因此,合理设计亲和力强、特异性高的核酸适配体的通用性策略方法具有极大的发展潜能和非常广泛的用途。小分子种类繁多,包括化学分子、寡肽、苷元等,对生命活动意义重大。小分子药物因其物理性质和化学性质决定了其良好的成药性和药物代谢动力学性质,这使其在药物研发、临床治疗中表现出巨大优势。核酸药物可以直接作用于与疾病相关的基因或蛋白,逐渐成为精准生物医学和疾病治疗的热点。因此,开发小分子的核酸适配体的设计方法将对小分子药物和核酸适配体药物的发展和研究都具有重大意义,可以为新兴药物靶标和新药开发等探索工作提供新的思路。目的:1.提出基于结构合理设计小分子的DNA适配体的策略;2.发展对不同靶标小分子的DNA适配体的合理设计方法;3.探索DNA适配体的最优设计方法和通用性策略;4.引发更多对合理设计功能性DNA分子的探索;5.为SELEX筛选方法提供技术补充。方法:1.基于结构的靶标小分子的DNA适配体的设计。分析靶标小分子的结构,根据DNA的Watson-Crick氢键和Hoogsteen氢键作用原理,在DNA NANEV、Sequin和Tiamat软件中设计DNA序列,构建人工的结合口袋;在Integrated DNA Technology网站内检查设计序列的合理性（例如有无其他的二级结构或碱基配对错误）;使用软件Coot和Pymol显示设计的DNA适配体与靶标小分子复合物的结构;2.DNA适配体的自组装及表征。使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）对DNA适配体的结构及其与小分子的结合情况进行表征。3.靶标小分子-DNA适配体复合物的表征、小分子与适配体相互作用的亲和力和特异性的表征。使用native-PAGE和等温滴定量热法（ITC）分别对DNA适配体的结构进行表征、考察它和小分子结合的亲和力。4.优化DNA适配体的结构,得到小分子的最佳DNA适配体。结果:1.靶标小分子三聚氰胺（MA）的DNA适配体设计基本原理的确定。以小分子MA为小分子模型,基于DNA三链体结构和MA结构设计了DNA适配体AptM,在酸性（p H 5.0）条件下胸腺嘧啶（T）和腺嘌呤（A）能自组装形成T·A-T,胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）能形成C-G·C+形式的三链体结构。在中性或碱性（p H 8.0）条件下由于无法形成C-G·C+三碱基体结构进而无法形成目标结构。2.DNA适配体的自组装及表征。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,在p H 5.0条件下AptM与MA分子有明显的结合;在p H 7.0和碱性（p H 8.0）条件下AptM二级结构无法形成。在凝胶内加入MA后,AptM与MA可以结合,且结合率与凝胶内MA分子浓度成正相关。3.评价DNA适配体识别靶标小分子的能力。（1）使用ITC测定了在p H 5.0时AptM与MA的亲和力,解离常数Kd值为10.3±0.5 n M,证实了二者极强的亲和力;（2）测定AptM与腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）、三磷酸鸟苷（GTP）和三聚氰酸（CA）的亲和力,表明AptM对MA具有很强的特异性。在p H 7.0时AptM与MA的Kd值为4.9±0.9μM,约为在p H 5.0时的475倍,进一步证明了结合的特异性。4.DNA适配体的碱基突变对适配体识别小分子的影响。（1）设计适配体突变体AptMa、AptMb、AptMc和AptMd;（2）使用ITC分别测定了它们与MA的亲和力,ITC数据表明氢键、三链体结构、碱基堆积力和静电作用力对结合有着重要的影响;（3）在AptM结构基础上进一步优化设计了AptMA,此结构可以降低结合过程额外的熵损失,ITC结果显示这一设计进一步提高了结合亲和力。5.拓展针对同一靶标小分子的不同的DNA适配体结构的设计。以AptM的三链体结构为基础,定制不同的DNA自组装结构（如双交叉分子）设计DNA适配体,ITC结果显示系列DNA适配体与小分子具有高亲和力和强特异性,进一步证明我们的设计思路的可行性。6.靶标小分子鸟苷的DNA适配体的设计及表征。把AptM的设计策略应用于鸟苷的适配体AptG,其解离常数Kd值为248.8±11.1 n M;与对照小分子腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）、三磷酸鸟苷（GTP）和三聚氰胺（MA）相比,AptG对鸟苷具有高特异性和强亲和力。后续基于AptG的结构,参考AptMA设计的思路,设计并优化得到了适配体AptGa。ITC实验结果显示AptGa与鸟苷的亲和力进一步得到了提高。结论:本文基于结构的分子设计原理,以靶标小分子和DNA三链体的结构为基础,通过构建人工的结合口袋,设计了强特异性、高亲和力的三聚氰胺和鸟苷的DNA适配体AptM和AptG。通过设计一系列的适配体突变体考察DNA适配体结构识别小分子的影响因素,证明了氢键、三链体结构、碱基堆积力和静电作用力是影响DNA适配体结构与小分子结合的关键因素。随后,以AptM的三链体结构为基础,将设计思路用于定制不同的MA的DNA适配体（如双交叉分子）,设计特异识别靶标分子的人工的结合口袋。ITC结果显示,系列DNA适配体与小分子具有高亲和力和强特异性,证明了我们对同一小分子的不同适配体的合理设计策略的可行性;我们在AptM和AptG结构的基础上优化得到亲和力更强的适配体的设计思路是可复制的。最后,我们针对不同小分子设计的DNA适配体AptM和AptG与靶标小分子作用都具有高亲和力和特异性,这说明了我们合理设计的适配体的通用性。以上研究结果表明了本文适配体设计思路的合理性与通用性。我们的这种设计有望激发更多对合理设计功能性DNA分子的探索,并为SELEX筛选方法提供有益的技术补充。更进一步地,开发小分子的核酸适配体的设计方法将对小分子药物和核酸适配体药物的研究和发展都具有重大意义。