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本试验对产气荚膜梭菌的研究包括三个方面:1、建立了用于产气荚膜梭菌定型的多重PCR方法。2、对产气荚膜梭菌的α、β和ε毒素基因进行了克隆表达。3、用表达的毒素蛋白分别制备了针对产气荚膜梭菌α、β和ε毒素的特异性血清。根据GenBank已发表的产气荚膜梭菌α,β,ε和ι毒素的基因序列,设计了分别针对α,β,ε,ι毒素基因的保守区的特异性引物,建立了产气荚膜梭菌多重PCR定型方法,其扩增片段的大小分别为202bp、403bp、585bp和291bp。用建立的多重PCR方法对本所保存的140株产气荚膜梭菌进行了定型,并用毒素抗毒素中和试验进行了验证,结果表明,多重PCR定型方法与毒素抗毒素中和试验的定型方法的结果完全一致,证明所建立的PCR定型方法是准确和特异的。与毒素抗毒素中和试验相比,应用多重PCR对产气荚膜梭菌定型具有快速,简单,经济的特点。根据GenBank已发表的产气荚膜梭菌α,β和ε毒素的全基因序列,设计了分别针对α,β和ε毒素基因完整成熟肽序列的引物,用PCR扩增出了三种毒素的全基因序列的片段,其大小分别为1125bp、942bp和918bp。应用基因克隆和重组技术,成功的构建了含有α,β和ε毒素完整成熟肽基因的表达载体,分别命名为α-pET28a、β-pET32a和ε-pET28a,经PCR、双酶切鉴定和测序鉴定,目的基因的已正确的插入到表达载体中,且目的基因的序列和阅读框架完全正确。将三种表达载体分别转化到受体菌中,命名为α-pET28a(plys)、β-pET32a(DE3)和ε-pET28a(DE3)。用IPTG对重组菌进行了诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting的检测结果表明,目的基因在受体菌中获得了表达且具有反应原性,重组α,β和ε蛋白的分子量分别约为46.1kDa、54.6kDa和36.6kDa,与预期的分子量大小相符。对重组菌的表达条件进行了优化,并对其表达形式和表达量进行了确定,结果表明,重组α、β和ε毒素蛋白在大肠杆菌的细胞质、周质和胞外均获得了表达,其中重组α、β毒素蛋白主要以包涵体的形式表达,没有天然毒素的毒性,表达量分别占到了菌体总蛋白的38.3%和24.6%;重组ε毒素蛋白主要在周质中以可溶性蛋白的方式表达,具有天然活性,其表达量占到了菌体总蛋白的29.3%,经0.3%的胰酶活化后,其每毫升菌液获得的ε毒素含有15000个小鼠MLD,其毒力与D型产气荚膜梭菌(C60-2)的毒力相近。分别用重组α、β和ε毒素蛋白免疫家兔,制备了其特异性血清,并用毒素抗毒素中和试验测定了其中和效价,结果表明,每毫升α毒素抗血清可以中和100个MLD的A型毒素,每毫升β毒素抗血清可以中和500个MLD的C型毒素;每毫升ε毒素抗血清可以中和30000个MLD的D型毒素。