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原发性肝癌(primary liver cancer, PLC)是常见的恶性肿瘤之一,近年来发病率有上升趋势,居全球恶性肿瘤第5位,每年新发病患者约62.2万例,死亡率居恶性肿瘤第3位,在我国,新发病患者约34万例/年,近11万人/年死于肝癌,在肿瘤相关死亡中居第2位。该病多见于中年男性,男女比例为2-5:1。PLC有三种病理学类型,即肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)、肝内胆管细胞癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)、肝细胞癌-肝内胆管细胞癌混合型,其中HCC居多,占90%以上。肝癌的病因根据地域的不同略有差异,在亚非地区约80%的HCC患者合并HBV或HCV感染,而欧美地区HCV感染及酒精性肝硬化为其主要致病原因。HCC的地域性分布还与食用黄曲霉毒素污染的食物、饮用含有藻类毒素的池塘水有关。此外,遗传、药物、寄生虫(华支睾吸虫、血吸虫等)、细菌感染等因素亦可能与HCC相关,这些因素能直接或间接的改变细胞的生长调控,导致细胞增生异常,引发肝癌。由于肝癌发生、发展隐匿,早期缺乏典型临床症状,一旦确诊,多已进入中晚期,仅有10%-30%的病人能行肿瘤切除治疗,且其术后5年生存率约为30%-60%,复发率约为80%,局部治疗转移、复发率更高,严重威胁病人的生命及生存质量。因此早期诊断与有效的治疗尤为重要,目前临床上应用广泛的诊断肝癌的血清肿瘤标志物为AFP,其阳性率仅为60%-70%,且妊娠、肝病活动期和生殖腺胚胎瘤时AFP表达亦可升高。因此寻找新的有效的肿瘤标志物及分子治疗靶点意义重大。类赖氨酰氧化酶1(Lysyl oxidase-like1, LOXL1)位于人染色体15q22,分布于弹性纤维存在的组织,参与局部组织中弹性蛋白的合成,也是弹性纤维发育成熟和保持内环境稳定的关键酶,在形成和维护细胞外基质结构中必可少。CBLC (Cas-Br-M (murine) ecotropic retroviral transforming sequence c)(?)属于RING型泛素连接酶E3,是泛素蛋白酶/溶酶体降解通路中的关键因子,对由泛素化引起的膜受体及下游信号传导分子在细胞内的降解过程中发挥重要作用,能够负调控细胞内信号传导。本研究分别应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹实验(Western Blot)方法检测人正常肝脏组织、肝硬化组织和肝癌组织中LOXL1、 CBLC基因及蛋白表达水平的差异,并应用免疫组织化学(Immunohistochemistry)方法检测分析LOXL1蛋白表达与肝癌分化及病理分级之间的关系。1.材料与方法1.1材料标本均取自2010年3月~2010年5月在河南省人民医院肝胆外科行肝脏手术者,诊断均经病理证实。共88例,其中23例人正常肝脏组织,取自于肝血管瘤病变部位的周围组织;22例肝硬化组织取自于门静脉高压行贲门周围血管离断术并行病理检查者;43例HCC组织,取自于HCC手术切除标本。正常肝脏组织HBsAg|阴性,肝硬化组织、HCC组织HBsAg均阳性。所取组织标本新鲜,并经患者知情同意。1.2方法1.2.1RT-PCR:分别提取人正常肝脏组织、肝硬化组织和HCC组织中的RNA;测定总RNA吸光度A260/A280值,衡量其纯度和完整性;按RT-PCR试剂盒要求步骤进行反转录PCR,扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,并行扫描和半定量分析。1.2.2Western blot检测:提取总蛋白后等浓度上样。Tricine-SDS-PAGE电泳分离蛋白后,转膜,一抗稀释液(LOXL11:750; CBLC1:600)(?)呼育,辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗稀释液(1:1000)孵育,ECL化学发光与曝光显影,并行半定量分析。1.2.3免疫组织化学:各组标本均行常规HE染色,经病理分级,采用免疫组化SP法检测,染色步骤按说明书进行,拍照并储存照片。1.3统计学处理:应用SPSS17.0统计学软件,多组定量资料比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD检验,定性资料选用卡方检验,所有数据均事先经正态性检验及方差齐性检验,以a=0.05为检验水准。2.结果2.1RT-PCR各组总RNA提取结果良好。电泳结果证实提取的是高纯度的RNA,总RNA的吸光度A260/A280值均在1.8~2.0之间;目的基因及内参基因扩增产物条带清晰。在正常肝脏组、肝硬化组和肝癌组中,LOXL1mRNA阳性表达率逐渐升高,分别为39.1%、68.2%和88.4%,三组间比较差异有统计学意义(x2=17.528,P<0.05),两两比较发现,正常肝脏组与HCC组、肝硬化组与HCC组、组间差异均有统计学意义(P均<0.05)。CBLC mRNA阳性表达率逐渐降低,分别为82.6%、54.5%和27.9%,三组间比较差异有统计学意义(x2=18.324,P<0.05),两两比较发现,正常肝脏组与HCC组、正常肝脏组与肝硬化组、肝硬化组与HCC组、组间差异均有统计学意义(P均<0.05)。2.2蛋白的表达正常肝脏、肝硬化和HCC组织中LOXL1阳性表达率分别为26.1%、54.5%和79.1%,三组间比较差异有统计学意义(x2=17.652,P<0.05),两两比较发现,正常肝脏组与HCC组、肝硬化组与HCC组、组间差异均有统计学意义(P均<0.05)。CBLC阳性表达率分别为78.3%、45.5%和20.9%,三组间比较差异有统计学意义(x2=20.352,P<0.05),两两比较发现,正常肝脏组与HCC组、正常肝脏组与肝硬化组、肝硬化组与HCC组、组间差异均有统计学意义(P均<0.05)。2.3免疫组织化学:正常肝脏、肝硬化和肝癌组织中LOXL1蛋白的阳性表达率分别为13.0%,45.5%和88.4%。HCC高、中、低分化组的阳性表达率分别为50.0%、93.8%、95.2%, Edmondson Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级的阳性表达率分别为25.0%、93.3%、94.4%、100%,不同分化程度(x2=10.001,P=-0.007)和不同病理分级(x2=17.423,P=0.001)的HCC组织中LOXL1的表达差异有统计学意义。HCC组织分化程度越低,病理分级越高,LOXL1表达越强。3.结论3.1LOXL1在HCC组织中高表达,而在肝硬化组织和正常肝脏组织农达依次减低,其在HCC中的表达强度与组织分化程度和病理分级相关,HCC组织分化程度越低,病理分级越高,LOXL1表达越强。LOXL1可能与肝癌形成有关。3.2CBLC在HCC组织中低表达,提示肝癌的发生可能与CBLC对细胞内信号传导的负调控作用异常有关,进一步研究其作用机制有可能为肝癌的分子靶向治疗和早期诊断提供新的途径。