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目的:以小胶质细胞、ERK1/2通路、Th1/Th2细胞和少突胶质细胞为切入点,探讨EAE的发病和复发机制以及益肾达络饮治疗EAE的疗效和作用机制,为MS的治疗提供理论依据。方法:(1)分组:在实验一中将40只雌性SJL小鼠(8-12周龄)随机分为正常组、模型组、中药组和激素组,每组各10只;在实验二中将60只雌性SJL小鼠(8-12周龄)随机分为正常组、模型组、中药组、激素组和PD98059组,每组各12只。(2)EAE模型的建立:在模型组、中药组、激素组和PD98059组中,每只小鼠上腹部,分两点皮下注射抗原乳剂 200 μL (含 PLP139-151 150μg、M. tuberculosis H37RA 400 μg),记为第1天。然后分别在第1天和第3天给予每只小鼠尾静脉注射百日咳杆菌液100 μL(含百日咳杆菌0.6 ×106个)。正常组小鼠不做任何处理。(3)干预方法:造模后第7天给药。实验一中,正常组和模型组每天给予双蒸水0.1ml/10g灌胃,中药组每天给予益肾达络饮0.1ml/10g(2g生药/ml)灌胃,激素组每天给予泼尼松药液0.1 ml/10 g (0. 39mg/ml)灌胃,共干预54天。实验二中,正常组、模型组、中药组和激素组的干预方式同实验一,共干预15天;PD98059组给予PD98059 0. 5mg/kg腹腔注射,每周1次,共3次。(4)取材时间:实验一的取材时间是免疫的第60天,实验二的取材时间是免疫的第21天。(5)观察指标:每天观察小鼠的行为学变化,称量体重,进行神经功能评分。用HE和Luxo1 fast blue染色观察小鼠的炎性细胞浸润和髓鞘脱失情况;western blot法检测 IL-2、IL-4、PLP、O1ig1、01ig2、Iba-1、Ras、p-c-Raf、c-Raf、p-MEK1/2、MEK1/2、p-ERK1/2和ERK1/2的水平,免疫组化法观察小胶质细胞的形态学改变。结果:实验一:益肾达络饮对EAE小鼠复发期的疗效和作用机制(1)益肾达络饮对EAE小鼠发病时间、发病率、复发时间及复发率的影响:模型组EAE小鼠的平均发病时间为12.4 ±0. 2天,发病率为80%,平均复发时间为48.2 ± 10. 3天,复发率为62. 5%;中药组EAE小鼠的平均发病时间为12. 7 ± 0. 3天,发病率为77. 8%,平均复发时间为第56天,复发率为14.3%;激素组EAE小鼠的平均发病时间为11.8±0.3天,发病率为60.0%,平均复发时间为53. 5 ±0.5天,复发率为33. 3%。中药组和激素组EAE小鼠的发时间、发病率、复发时间和复发率与模型组比较无差异(P>0. 05)。(2 )益肾达络饮对EAE小鼠Weaver评分的影响:模型组、中药组和激素组EAE小鼠平均最高Weaver评分均出现在免疫第14天,各组之间比较无差异(P>0. 05);免疫第21天,激素组EAE小鼠的Weaver评分低于模型组(P<0. 05 );免疫第60天,中药组EAE小鼠的Weaver评分低于模型组(P<0. 05)。(3)益肾达络饮对EAE小鼠病理学变化的影响:H-E染色结果显示,正常组小鼠的脑和脊髓组织着色均匀,细胞结构完整。模型组EAE小鼠的脑和脊髓组织可见多个部位的局限性炎性病灶,病灶处有大量的炎性细胞浸润,炎性病灶以小血管为中心,形成典型的“袖套样”改变。中药组和激素组EAE小鼠的脑和脊髓组织炎性浸润病灶明显减少,程度减轻。(4)益肾达络饮对EAE小鼠髓鞘脱失情况的影响:固兰染色结果显示,正常组小鼠的脊髓组织髓鞘致密,排列整齐。模型组EAE小鼠的脊髓组织存在明显的髓鞘脱失,呈现出“空泡样”改变。中药组和激素组EAE小鼠的脱髓鞘程度较模型组明显减轻。(5)益肾达络饮对EAE小鼠IL-2、IL-4的影响:Western结果显示,模型组IL-2的表达水平明显高于正常组(K0. 05),中药组和激素组IL-2的表达水平低于模型组(P<0. 05),并且激素组更加明显。模型组和激素组IL-4的表达水平略高于正常组,但差异无统计学意义(P>0. 05);中药组IL-4的表达水平明显高于模型组和激素组(P<0. 05)。(6)益肾达络饮对EAE小鼠髓鞘再生的影响:Western结果显示,模型组EAE小鼠PLP的水平低于正常组(P<0.05),中药组和激素组EAE小鼠的PLP水平较模型组升高(P<0. 05)。中药组EAE小鼠O1ig1的表达水平明显高于模型组和激素组(P<0. 05),01ig2的表达水平高于模型组(P<0. 05 )。实验二:益肾达络饮对EAE小鼠急性期的疗效和作用机制(1)益肾达络饮对EAE小鼠发病时间和发病率的影响:模型组EAE小鼠的平均发病时间为11. 4 ±0.2天,发病率为75%;中药组EAE小鼠的平均发病时间为12. 8 ±0.6天,发病率为75%;激素组EAE小鼠的平均发病时间为12. 7± 0.5天,发病率为91.7%; PD98059组EAE小鼠的平均发病时间为11. 9 ±0.4天,发病率为75%。中药组、激素组和PD98059组的发病率与模型组比较无差异(P>0.05);中药组和激素组的发病时间与模型组比较延迟(P<0. 05 )。(2)益肾达络饮对EAE小鼠Weaver评分的影响:中药组、激素组和PD98059组的最高weaver评分与模型组比较无差异(P>0.05);免疫第21天,中药组、激素组和PD98059组的Weaver评分均低于模型组(P<0. 05 ),三组比较无差异(P>0. 05 )。(3)益肾达络饮对EAE小鼠小胶质细胞活化(MG)的影响:免疫组化结果显示,正常组MG的数量较少,细胞核细长,树突细,Iba-1的表达很少;模型组MG的数量增多,细胞胞体变大,树突增粗,Iba-1的表达显著增多;中药组、激素组和PD98059组MG的数量较模型组减少,胞体变小,树突变细,Iba-1的表达减少。Western结果显示,模型组Iba-1的表达水平较正常组增多(P<0. 05),中药组、激素组和PD98059组Iba-1的表达水平降低(P<0. 05 )。(4)益肾达络饮对EAE小鼠ERK1/2通路的影响:模型组EAE小鼠p-c-Raf、p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达水平高于正常组(P<0.05);中药组、激素组和PD98059组p-c-Raf的表达水平高于正常组(P<0.05),与模型组比较无差异(P>0.05)。中药组、激素组和PD98059组EAE小鼠p-MEK1/2的表达水平低于模型组(P<0. 05,P<0. 05,P<0. 01); PD98059组EAE小鼠p-MEK1/2的表达水平低于正常组(P<0. 05);中药组、激素组和PD98059组EAE小鼠p-ERK1/2的表达水平低于模型组(P<0. 05 )。Ras、c-Raf、MEK1/2和ERK1/2的表达水平,各组之间比较无差异(P>0. 05 )。结论:(1) Th1/Th2细胞的平衡失调与EAE的复发有关,益肾达络饮可以通过降低EAE小鼠IL-2的水平,升高IL-4的水平,调节Th1/Th2平衡失调,防止EAE的复发,降低EAE小鼠复发期的神经功能评分,减轻炎性细胞浸润和髓鞘脱失。(2)少突胶质细胞参与了 EAE小鼠的髓鞘再生,益肾达络饮可以通过升高O1ig1和01ig2的水平,促进少突胶质细胞的分化成熟,从而促进髓鞘再生,加快EAE小鼠的神经功能缺损症状的恢复。(3)小胶质细胞和ERK1/2通路的激活参与了 EAE的发病,益肾达络饮可以通过抑制小胶质细胞和ERK1/2通路的激活,降低EAE小鼠的神经功能评分,延迟发病时间。