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双乙酰是葡萄酒酿造过程中酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵的副产物,当双乙酰浓度较高时,会产生令人生厌的馊饭味。在酵母酒精发酵过程中,双乙酰可以被还原为乙偶姻,进一步还原成2,3-丁二醇。本课题对双乙酰还原途径中的关键基因BDH1和BDH2进行了深入研究,利用基因工程手段构建重组葡萄酒酵母菌株,并对葡萄酒发酵条件进行了优化,以降低葡萄酒中双乙酰的含量。主要研究内容如下:(1)对实验室保藏的5株葡萄酒酵母(Saccharomyces uvarum)以耐酒精、耐SO2、耐高糖和发酵性能为指标进行了比较,筛选得到了一株发酵性能优良的葡萄酒酵母WY1作为出发菌株。(2)在葡萄酒发酵后期加入蔗糖,促使酵母产生二次发酵以降低双乙酰的含量。通过葡萄酒发酵实验得出:加糖二次发酵的最适加糖量为28g/L,与常规苹-乳发酵相比,加糖二次发酵使双乙酰含量降低了29.87%。(3)利用基于PCR技术的同源重组,于葡萄酒酵母WY1中分别敲除基因BDH1和BDH2,验证两基因对双乙酰还原效果的影响,构建转化子WY1Δ1和WY1Δ2。葡萄酒发酵实验表明,WY1 Δ 1和WY1 Δ2分别使双乙酰含量提高了37.15%和25.88%。(4)利用基于PCR技术的同源重组和Cre/loxP报告基因挽救系统,构建BDH1和BDH2基因的过表达菌株WY1-1(过表达BDH1基因)、WY1-2(过表达BDH2基因)和WY1-12(同时过表达BDH1和BDH2基因)。通过三种葡萄酒发酵实验,测定双乙酰的含量,得出结果如下:在常规葡萄酒发酵实验中,WY1-1、WY1-2和WY1-12的双乙酰含量比出发菌株分别降低了28.05%、26.0%和31.05%;苹-乳发酵实验中,与出发菌株WY1相比,WY1-1、WY1-2和WY1-12分别使双乙酰含量降低了31.01%,23.88%和43.17%;加糖二次发酵实验中,WY1-1、WY1-2和WY1-12发酵后双乙酰含量分别降低了39.87%,33.42%和46.71%。