卡波西样血管内皮瘤血管生成三维模型的培养和建立

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背景血管瘤是婴幼儿时期最常见的肿瘤之一,其中占绝大多数的婴幼儿血管瘤(infantile hemangioma,IH),目前应用局部药物注射及口服普萘洛尔治疗,已经取得了良好的治疗效果,形成了比较理想且规范的治疗指南。卡波西样血管内皮瘤(Kaposi-form hemangioendothelioma,KHE)虽在血管瘤中仅占少数,却是血管瘤中的重症。KHE最早由Zerberg等人于1993年报道,是一种组织形态类似于卡波西肉瘤且具有侵袭性生长特质的肿瘤,常发生于婴幼儿及低龄儿童,疾病发展快,常伴发表现为血小板减少及消耗性凝血功能障碍的卡梅现象(Kasabach-Merritt phenomenon,KMP)[1]。在最新的国际血管瘤和脉管畸形研究学会(the International Society for the Study of Vascular Anomalies,ISSVA)发布的血管瘤与脉管畸形分类方法中,将卡波西样血管内皮瘤定义为“具有局部侵袭性行为或交界性的脉管肿瘤”,并明确KMP是其特征性表现[2]。卡波西样血管内皮瘤临床上主要表现为局部侵袭性生长的巨大血管瘤,无自愈倾向,常伴发主要表现为血小板减少、低纤维蛋白原血症、微血管性消耗性贫血以及严重凝血功能障碍的特征性综合征——卡梅现象。因其患病个体多为婴幼儿,症状重,发病急,短期内病情进行性加重,加上发生于纵膈、腹膜后等深部组织的KHE存在及时诊断上的困难,导致该病的病死率高达12%-30%[3,4]。卡波西样血管内皮瘤的发病机制及导致血小板减少及凝血功能障碍的机制尚不清楚,而该病病例数量少,缺乏大样本的回顾性研究,难以形成具有循证医学基础的证据,导致国内乃至国际上对KHE的治疗方法及治疗规范均未形成统一的意见[5,6]。如此的现状使得KHE成为目前血管瘤临床治疗中最突出、最棘手的问题。动物模型是探索研究疾病的病因、发病机制、防治技术和治疗药物的重要临床研究工具。然而目前为止仍未有成功的卡波西样血管内皮瘤动物模型的报道。目前血管瘤的研究主线是其血管生成的促发和调节机制,因此我们设想通过一种新的方式构筑能够反映卡波西样血管内皮瘤血管生成过程的体外动物模型——将KHE组织块切片包埋在纤维蛋白凝胶内,置于培养板内培养,使其在纤维凝胶中长出新生血管,即卡波西样血管内皮瘤血管生成三维模型。该构筑方法可以解决造成KHE动物模型构筑困难的关键问题,建立完成后将为血管瘤血管生成的研究提供良好的模型,可用于药物有效性及作用效果、KHE发生发展和转化、KMP产生原理和发展过程等的观察研究,为KHE及KMP的相关研究提供新的可能性和新的思路。方法1.标本准备:将手术切除的增殖期血管瘤新鲜标本立即浸于4℃的Hanks液,洗净血痂,再浸于无血清的EGM-2培养基中保存,在室温下去除正常皮肤及多余脂肪,剪碎成1mm3的组织块备用。将所剩手术标本送常规病理切片及免疫组化实验。2.制备培养体系(双层夹心法):预先将青霉素、链霉素、氨基己酸、胎牛血清加入含内皮细胞生长因子套装的EGM-2培养基中制成完全培养基,实验开始后将纤维蛋白原(最终浓度为2.5mg/ml)溶于其中,取0.7ml加入24孔培养板的培养孔中,迅速混合凝血酶(0.5U/ml)后,静置10min后形成下层凝胶,在下层凝胶上植入1mm3的组织块,于其上层按相同的步骤加入上述相同的培养基、纤维蛋白原和凝血酶混合液0.7ml,静置形成上层凝胶,再加入同上的完全培养基1ml。每例可据实验要求于24孔培养板重复配制数孔,便于分组比较。3.孵育:将培养板置于37℃含5%CO2的潮湿孵箱中,2天更换一次培养液,换液的同时观察血管生成情况。4.培养血管的鉴定(HE染色观察及免疫组化实验):将培养后的凝胶整体制成冰冻切片,作HE染色;另行免疫组化并与标本来源的免疫组化结果进行对比。结果纤维蛋白凝胶培养体系植入卡波西样血管内皮瘤组织块2-4日后,显微镜观察可见自组织块边缘向外延伸生长出细小的“树枝状”新生血管,新生的血管交错叠加成网状结构。后生长较快,新生血管数逐渐增多,至12-16日后生长情况趋于稳定,低倍镜下见新生的血管网基本可以覆盖整个视野,高倍镜下可以看见明显的管腔样结构。持续营养供给的情况下,至26-30日后开始出现管腔样结构裂解坏死。取培养的组织块制成冰冻切片后行HE染色,染色完成后显微镜下观察可见原组织块符合卡波西样血管内皮瘤特征,组织周边延伸出的“树枝状”结构截面为环形或椭圆形中空管腔,管壁组成结构为单层扁平上皮细胞,可见深染的梭形细胞核。另取切片行免疫组化实验,结果是GLUT-1结果呈阴性,D2-40、CD31及CD34结果均成阳性,与组织供体术后免疫组化结果一致,与目前公认的卡波西样血管内皮瘤的免疫组化特征一致,证实新生的血管网由卡波西样血管内皮瘤血管上皮细胞组成。结论纤维蛋白凝胶培养体系能够完成卡波西样血管内皮瘤三维血管生成模型的培养,新生的血管成“树枝样”网状结构,自原组织块向外延伸,2-4日可见血管生成,12-16日结构稳定,存活时间可达26日以上。本模型提供了卡波西样血管内皮瘤的优秀精确动物模型。培养时间短,存活时间长,操作简便并提供了可观的实验研究时间窗,真实的反应了瘤体活性及血管生成的过程。该模型可用于药物有效性及作用效果、卡波西样血管内皮瘤的发生发展和转化、卡梅现象产生原理和发展过程等的观察研究,为KHE及KMP的相关研究提供了新可能和新思路。
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