研究背景:动脉粥样硬化是严重危害人类健康的疾病之一,是冠状动脉粥样硬化性心脏病、卒中及外周血管疾病等心血管疾病的共同病理基础。血管内膜泡沫细胞的形成是动脉硬化早期斑块开始形成的重要标志,在动脉粥样硬化的发生发展过程中起着至关重要的作用,也是预防和治疗动脉粥样硬化的关键靶点。大量流行病学调查研究证明,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平与心血管疾病风险呈负相关。胆固醇逆转运(RCT)是HDL拮抗动脉粥样硬化的重要机制。HDL作为胆固醇的接受体及运载体,可将外周组织(包括动脉粥样硬化斑块中的泡沫细胞)中多余的胆固醇转运至肝脏,经过代谢合成胆汁酸,最终通过粪便排出体外,此过程即RCT。三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)和G1(ABCG1)在RCT过程中发挥重要的互补作用。ABCA1在RCT起始过程中,将外周组织胆固醇转运至乏脂的载脂蛋白,如ApoA-I,及ApoE,合成新生HDL。ABCG1则介导胆固醇从巨噬细胞转运至成熟的HDL颗粒。在动脉粥样硬化过程中,ABCA1及ABCG1表达降低,进一步加重胆固醇累积和泡沫细胞形成。因此,ABCA1和ABCG1是RCT调节过程中起关键作用的转运蛋白。上调ABCA1、ABCG1的表达可以改善HDL调节RCT的功能,进一步调控动脉粥样硬化。C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白(CTRP)家族是近年来发现的新型脂肪因子家族,包括15个成员,其中CTRP9与脂联素同源性最高。最近的研究表明,冠心病患者及动脉粥样硬化模型小鼠血清CTRP9水平降低,提示CTRP9具有心血管保护作用。已有国内外研究证实CTRP9可通过调节内膜增生及血管平滑肌细胞增殖和迁移等机制参与调控动脉粥样硬化过程,但CTRP9是否在RCT过程中发挥作用,进一步调节动脉粥样硬化的具体机制,尚无研究报道。实验一CTRP9对动脉粥样硬化模型小鼠RCT的影响目的:在体研究CTRP9对动脉粥样硬化模型小鼠胆固醇流出及血脂水平的影响。方法:采用雄性ApoE基因敲除小鼠,给予高脂饲料(21%猪油+0.21%胆固醇)喂养10周建立动脉粥样硬化模型,通过皮下置入植入式胶囊渗透压泵,持续给予CTRP9作用4周,根据CTRP9给予浓度不同分为以下3组:(1)对照组:给予PBS;(2)0.1μg/g/day组:给予0.1μg/g/day CTRP9;(3)0.25μg/g/day组:给予0.25μg/g/day CTRP9。采用冰冻切片油红O染色、HE染色检测小鼠主动脉粥样硬化斑块病变程度。小鼠腹腔注射经~3H-胆固醇处理过的RAW264.7巨噬细胞悬液后,开始收集48h内粪便,48h结束后收集血清、肝脏组织,采用液体闪烁计数仪测定在体胆固醇流出率。采用酶氧化法检测小鼠血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇等血脂水平。采用real-time PCR及western blot法检测小鼠肝脏ABCA1、ABCG1、LXR-αmRNA及蛋白表达水平。结果:CTRP9可显著缩小动脉粥样硬化模型小鼠斑块面积,减轻动脉粥样硬化斑块病变程度,增加胆固醇经血清、肝脏及粪便的排出率,使血清高密度脂蛋白胆固醇水平升高,低密度脂蛋白胆固醇水平降低,上调肝脏中ABCA1、ABCG1、LXR-α的mRNA及蛋白水平。结论:CTRP9可通过上调ABCA1、ABCG1、LXR-α的表达,促进在体胆固醇流出,影响动脉粥样硬化小鼠血脂水平,减轻动脉粥样硬化斑块病变程度。实验二CTRP9对泡沫细胞RCT影响的浓度依赖性及时间依赖性目的:离体研究不同浓度CTRP9作用不同时间对RAW264.7源性泡沫细胞胆固醇流出的影响。方法:体外培养RAW264.7巨噬细胞,用50mg/L氧化低密度脂蛋白处理24h诱导巨噬细胞转化为泡沫细胞,按照CTRP9作用浓度不同分为以下4组:(1)对照组:正常泡沫细胞不给予任何处理;(2)0.3μg/mL组:给予0.3μg/mL CTRP9孵育3h;(3)1μg/mL组:给予1μg/mL CTRP9孵育3h;(4)3μg/mL组:给予3μg/mL CTRP9孵育3h。选取最佳作用浓度,按照CTRP9不同作用时间分为以下4组:(1)对照组:正常泡沫细胞不给予任何处理;(2)1h作用组:给予最佳作用浓度CTRP9孵育1h;(3)3h作用组:给予最佳作用浓度CTRP9孵育3h;(4)6h作用组:给予最佳作用浓度CTRP9孵育6h。采用液体闪烁仪测定泡沫细胞胆固醇流出率。采用高效液相色谱法分析泡沫细胞内总胆固醇、游离胆固醇及胆固醇酯含量。采用real-time PCR及western blot法检测泡沫细胞ABCA1、ABCG1基因及蛋白表达水平。结果:与对照组相比,随着作用浓度的增高及作用时间增长,CTRP9可显著增加RAW264.7源性泡沫细胞胆固醇流出率,降低细胞内胆固醇含量,上调ABCA1、ABCG1基因及蛋白的表达。CTRP9最佳作用浓度为3μg/mL。随着作用时间增长,以上作用在3h时达到顶峰,在6h作用点开始下降。结论:CTRP9可通过上调ABCA1、ABCG1基因及蛋白表达,促进RAW264.7源性泡沫细胞胆固醇流出,抑制泡沫细胞形成,且此作用具有浓度依赖性及时间依赖性。实验三CTRP9对泡沫细胞RCT影响的信号转导机制目的:离体研究CTRP9对RAW264.7来源泡沫细胞胆固醇流出的信号转导机制。方法:体外培养RAW264.7巨噬细胞,用50mg/L氧化低密度脂蛋白处理24h诱导巨噬细胞转化为泡沫细胞,给予LXR-α-siRNA抑制细胞内源性LXR-α表达,观察LXR-α在CTRP9影响泡沫细胞胆固醇流出中的作用,按处理不同分为以下4组:(1)对照组:正常泡沫细胞不给予任何处理;(2)CTRP9组:给予3μg/mL CTRP9共同孵育3h;(3)LXR-α-siRNA组:给予50nM LXR-α-siRNA干预泡沫细胞;(4)LXR-α-siRNA+CTRP9组:给予50nM LXR-α-siRNA干预泡沫细胞后,3μg/mL CTRP9共同孵育3h。体外培养RAW264.7巨噬细胞,用50mg/L氧化低密度脂蛋白处理24h诱导巨噬细胞转化为泡沫细胞,给予AMPK-siRNA抑制细胞内源性AMPK表达,观察AMPK在CTRP9影响泡沫细胞胆固醇流出中的作用,按处理不同分为以下4组:(1)对照组:正常泡沫细胞不给予任何处理;(2)AMPK-siRNA组:给予50nM AMPK-siRNA干预泡沫细胞;(3)AMPK-siRNA+CTRP9组:给予50nM AMPK-siRNA干预泡沫细胞后,3μg/mL CTRP9共同孵育3h;(4)CTRP9组:给予3μg/mL CTRP9共同孵育3h。采用液体闪烁仪测定泡沫细胞胆固醇流出率。采用高效液相色谱法分析泡沫细胞内总胆固醇、游离胆固醇及胆固醇酯含量。采用real-time PCR及western blot法检测泡沫细胞ABCA1、ABCG1、LXR-α、AMPK基因及蛋白表达水平。结果:与CTRP9组相比,分别采用LXR-α-siRNA和AMPK-siRNA阻断泡沫细胞内源性AMPK表达后,CTPR9对于增加RAW264.7源性泡沫细胞胆固醇流出率,降低细胞内胆固醇含量,上调ABCA1、ABCG1表达,抑制泡沫细胞形成的作用被显著抑制。结论:CTRP9通过AMPK-LXR-α-ABCA1/ABCG1途径促进细胞内胆固醇流出,降低细胞内胆固醇含量,抑制动脉粥样硬化过程中泡沫细胞的形成。实验四CTRP9与早发冠心病的相关性研究目的:研究早发冠心病患者的临床特点及血浆CTRP9水平,探讨CTRP9水平和早发冠心病的相关性。方法:收集2016年5月至2018年5月就诊于山西医科大学第二医院心内科行冠状动脉造影的患者149例。依据病变分为对照组(49例)和早发冠心病组(100例)。依据冠心病分型将早发冠心病组分为稳定型心绞痛组(SAP)35例,不稳定型心绞痛组(UAP)33例,急性心肌梗死组(AMI)32例。按照冠脉病变支数不同分为单支病变组42例,双支病变组33例,多支病变组25例。按照Gensini评分将冠脉病变程度不同分为轻度病变组47例,中度病变组34例,重度病变组19例。收集患者一般临床资料及生化指标情况。酶联免疫法检测血浆CTRP9水平。对CTRP9水平与早发冠心病发病进行相关性分析,并采用Logistic回归分析早发冠心病的发病因素,评估CTRP9与不同冠脉病变程度的相关性。结果:与对照组相比,早发冠心病组男性、高血压病史、冠心病家族史、吸烟史患者比例明显增加,BMI、TG水平明显升高,HDL-C水平、CTRP9水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。男性、吸烟、高血压病史、糖尿病病史、冠心病家族史是早发冠心病的危险因素,HDL-C和CTRP9是早发冠心病的保护因素。与对照组相比,SAP组、UAP组、AMI组CTRP9水平依次下降,且均具有统计学意义。AMI组较SAP组CTRP9水平显著下降,差异具有统计学意义,SAP组和UAP组、UAP组合AMI组相比,CTRP9水平差异无统计学意义。与对照组相比,单支病变组、双支病变组、多支病变组CTRP9水平依次下降,且均具有统计学意义。多支病变组较单支病变组CTRP9水平显著下降,差异具有统计学意义,双支病变组和单支病变组、多支病变组和双支病变组相比,CTRP9水平差异无统计学意义。与对照组相比,轻度病变组、中度病变组、重度病变组CTRP9水平依次下降,且均具有统计学意义。重度病变组较轻度病变组CTRP9水平显著下降,差异具有统计学意义,中度病变组和轻度病变组、重度病变组和中度病变组相比,CTRP9水平差异无统计学意义。结论:男性、吸烟史、高血压病史、糖尿病病史、冠心病家族史,及HDL-C水平、CTRP9水平下降是早发冠心病发病的危险因素。CTRP9水平与早发冠心病冠脉病变程度相关,高CTRP9水平可能发挥抗动脉粥样硬化的保护作用。