论文部分内容阅读
活细胞和活体层面获取生物分子的化学生物信息对于人们了解其在各种生理活动中的作用具有重要意义。传统的一对一信号输出模式的荧光探针对一些浓度含量极低重要生物活性分子检测提出了的挑战。因此,发展生物体内原位信号放大新方法是实现对低丰度物质实时成像、原位分析的关键。现有的信号放大策略能够获得较高的检测灵敏度,但由于放大过程中需要外源性辅助酶等工具等,限制此种信号放大策略大多只能用于体外均相检测分析。在为数不多的已报道实现细胞内信号放大的方法中,由于所采用的核酸识别模式,使其检测对象局限于核酸DNA,而不适用于其他活性小分子的检测。因此,提出利用细胞内源性物质作为信号放大器,发展出适用于多种小分子分析的细胞内原位信号放大方法,对于现有的荧光分析检测具有重要意义。本论文通过将细胞内胞浆蛋白作为信号放大器,利用介孔硅、有机聚合物胶束等纳米颗粒作为载体,能够与细胞基质结合后达到荧光信号增强的近红外染料为信号报告单元,制备出一系列能够在原位实现信号放大的荧光纳米探针,并对一些低丰度目标物进行检测分析,证明了此种信号放大策略能很好解决现有信号放大的问题。1)PEI-?CDP/SQ@BHQ2近红外荧光纳米探针的构建及对?OH的检测极性敏感型染料是一类对不同极性溶剂产生明显物理化学变化的有机小分子,我们在本部分合成一系列分子结构相近的方酸类近红外染料SQs,并考察其在缓冲溶液及含有胎牛血清体系中光学性质变化,优化得到所需荧光体SQ1。通过SQ1与环糊精聚合物PEI-?CDP相互作用,并静电吸附BHQ2-ss DNA形成PEI-?CDP/SQ@BHQ2探针对?OH进行检测。当体系中存在?OH时,?OH可切断BHQ2-ss DNA使BHQ2脱离,进而恢复PEI-?CDP/SQ@BHQ2荧光对?OH进行检测。本章筛选出的SQ1在疏水相中有大幅度荧光增强,同时?CDP/SQ@BHQ2对?OH的有效地响应证明了ss DNA被?OH切断可作为触发开关应用到?OH探针设计中,这也为该论文第二部分工作奠定了基础。2)胞浆蛋白辅助荧光信号放大策略用于活体内?OH原位成像?OH在生物体内浓度极低(（27）10-9 mol/L),且寿命很短（（27）10-1212 s）,对其检测大多停留在细胞层面。我们在第一部分的基础上,研究SQ与蛋白发生结合作用机理,并利用修饰了ss DNA的介孔硅纳米颗粒包载SQ后在表面吸附能将SQ荧光猝灭的聚合物分子形成纳米放大器。在此设计的纳米放大器在?OH存在时,能快速将ss DNA切断从而使聚合物分子脱离,纳米放大器内部的染料SQ得以释放,SQ与聚合物分子分离将点亮纳米探针荧光并实现第一次信号放大,同时,自由态的SQ可以与细胞内蛋白结合实现第二次荧光信号增强放大,从而对?OH原位二次信号放大检测。通过实验我们发现此探针对?OH的响应非常灵敏,检出限达到p M级,这是从未报道过的。而且,我们用过实验证明了纳米探针能够对细胞内?OH进行实时检测,从而证明?OH在细胞内产生的信号通路,通过活体实验也说明了纳米探针能够对活体内的?OH进行成像。3)胞浆蛋白辅助双重信号放大荧光探针用于缺氧检测及活体内炎症成像炎症的发展过程中伴随着缺氧微环境的产生,因此缺氧可以做为炎症的标志物。目前已报道的缺氧响应型荧光探针受限于灵敏度,而大多只能用于缺氧更严重的肿瘤成像。针对此问题,我们利用介孔硅包载SQ后在表面设计出缺氧响应开关,此探针能够灵敏地对缺氧微环境做出响应。由实验结果可以得出,此探针不仅能够在细胞层面上对缺氧微环境进行响应,同时,对患结肠炎的小鼠模型也能够很好地反映炎症的发展程度。此工作是第一次设计出缺氧响应的信号放大探针并用于活体内炎症成像,解决了目前炎症成像中所面临的问题。4)胞浆蛋白辅助多重信号放大荧光探针用于m RNA的检测及成像:避免复杂环境中信号波动目前所报道的细胞内核酸DNA荧光信号放大检测探针多是建立在核酸识别模式上,信号放大后不可避免要面临细胞内复杂环境对信号单元造成破坏的问题。针对此问题,我们利用可与目标核酸发生链杂交式反应的核酸探针吸附在介孔硅纳米颗粒表面进行堵孔,同时内包近红外染料SQ形成纳米探针。当纳米探针在细胞内部可与目标核酸DNA发生杂交链式反应将介孔硅打开,内部染料释放出来后可与细胞内蛋白结合大幅度提高荧光信号,从而实现对目标核酸的超灵敏检测。通过实验结果也证明了该纳米探针能够对细胞内的目标核酸序列进行检测并成像,而且,与之前所报道的以核酸DNA为目标物的信号放大策略对比,此纳米探针在细胞复杂的生物微环境中实现信号放大后,染料与细胞内蛋白结合后可以避免遭到核酸酶的降解,因此可在较长时间内保证荧光信号稳定不波动,解决了现存核酸信号放大探针所面临的信号稳定问题。利用细胞内稳定存在的蛋白质作为信号放大器,通过纳米载体包覆荧光信号单元,再通过合理的开关设计,就可控制信号报告单元与蛋白质的结合来实现对低丰度目标检测物的放大检测,这克服了传统荧光信号放大法中对辅助物依赖的缺点,并扩大了荧光信号放大探针应用范围,对于荧光信号放大探针在生物传感领域应用具有重要意义。