乙肝病毒DNA聚合酶基因小分子双链干扰RNA制剂工艺及药效学研究

来源 :哈尔滨医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xuezhenqian
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乙肝在国内是一种发病率较高的病毒性传染疾病,本文探讨利用RNA干扰(RNA Interference:RNAi)技术研究开发治疗乙肝的有效药物的可能途径。   针对乙肝病毒DNA聚合酶基因设计500bp的核苷酸序列,插入表达载体,构建出能表达目标基因双链RNA(dsRNA)的工程细胞株,经发酵、提取纯化500bp大小的dsRNA分子,体外经Dicer酶切成21~23bp大小的siRNA,采用阳离子和分子筛柱层析法进行纯化,并将纯化得到的siRNA制备成脂质体制剂,利用了三种细胞模型及动物模型对其抗病毒活性进行研究。   结果表明:经质量控制检测,该siRNA制备工艺稳定可靠,siRNA纯度可达98.69%。用基因工程法制备的siRNA具有生物学活性,在体外细胞模型中可以特异性地抑制病毒DNA聚合酶基因的表达,从而抑制病毒DNA复制及表面抗原的表达,有效地抑制病毒繁殖,其对DNA复制的抑制率可达到85.46%,对表面抗原的抑制率可达到68-85%。在高压尾静脉注射动物模型中,脂质体具有靶向肝部的能力,siRNA对病毒表面抗原的抑制率可达到85%以上。在A型和C型转基因小鼠模型中,siRNA对病毒DNA复制的抑制率可达到46.74%,对表面抗原的抑制率可达到35.09%,差异显著。免疫组化分析抑制率可达到56.20%。细胞模型及转基因动物模型表明利用基因工程菌表达的双链RNA分子在体外经Dicer酶切制备的小分子RNA脂质体制剂,能有效地抑制乙肝病毒DNA的复制及表面抗原的表达,为进一步开发此类产品创制了条件。
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