肝癌是一种高发病率和高死亡率的恶性肿瘤，严重威胁人类的生命健康。其中，70％~90%的肝癌为肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）。HCC的致病因素非常复杂，包括病毒感染、肥胖、2型糖尿病、酒精性肝硬化以及非酒精性脂肪肝等。临床数据显示，HCC的转移和复发是患者不良预后以及死亡的最重要因素，HCC晚期患者的自然生存时间仅为3个月。　　肿瘤转移是一个复杂的过程，肿瘤细胞通过抑制细胞增殖、激活细胞分化和抗凋亡（Anti-apoptosis）、改变细胞特征（由上皮细胞转化为间质干细胞）、降低细胞间附着程度、降解细胞间连接、激活细胞表面蛋白酶溶解细胞外基质（ECM）等过程，达到向外迁移的目的。随着循环系统，迁移的细胞通过MET过程从血液侵入靶向组织或靶向器官，形成转移灶，最后再发展成为新的肿瘤。　　HCC的转移和复发是影响患者生存率的首要原因，是突破肿瘤研究最主要的切入点。目前，研究人员已经积累了大量的有关HCC转移的研究资料，但是，仍然不能清楚地解释HCC转移过程的分子机制。　　在前期实验中，我们通过蛋白质组学分析，在遗传背景相同但转移能力不同的肝癌细胞系中发现Rab27B可能为HCC转移正相关的候选分子，并在细胞水平发现Rab27B能够促进人肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本实验进一步在裸鼠体内证明了Rab27B可影响肝癌细胞的增殖，并对Rab27B介导HCC转移的分子机制进行了初步研究。　　一、裸鼠皮下成瘤实验证明Rab27B可影响肝癌细胞的增殖。　　在BalB/C- nu/nu裸鼠皮下接种肝癌细胞（对照组MHCC97H-NC以及敲低组MHCC97H-shRab27B），观察裸鼠皮下成瘤情况。结果显示，人肝癌细胞敲低Rab27B后，其体内成瘤能力被显著抑制（P＜0.05），首次在体内证明Rab27B分子与HCC的增殖能力正相关。　　二、外泌体抑制剂实验表明Rab27B对HCC转移能力的影响部分依赖于外泌体途径。　　Rab27B主要的分子功能是参与调控外泌体分泌。在肝癌细胞（对照组MHCC97L-GFP和过表达组MHCC97L-Rab27B）中加入外泌体抑制剂DMA，通过 CCK-8和划痕实验检测其对细胞增殖和迁移能力的影响。结果显示，两组细胞的增殖均被显著抑制（P＜0.05），而且过表达组细胞增殖受抑制程度明显低于对照组（P＜0.05）。因此，DMA虽然能通过抑制外泌体分泌抑制肝癌细胞增殖，但是并不能完全抑制由Rab27B引起的细胞增殖。同样地，DMA处理后能够抑制肝癌细胞迁移，但是并不能完全抑制细胞迁移现象。因此，Rab27B不仅能够通过调控肝癌细胞的外泌体分泌影响细胞增殖和迁移，还存在不依赖于外泌体分泌途径的调控过程。　　三、Rab27B依赖于外泌体途径调控HCC转移的机制研究。　　为了研究Rab27B可影响哪些蛋白质通过外泌体进行分泌，本实验使用超速离心法提取肝癌细胞（对照组MHCC97H-NC和敲低组MHCC97H-Rab27B）培养上清中的外泌体。通过细胞计数以及外泌体蛋白定量分析，发现敲低组单位细胞分泌的外泌体蛋白量显著低于对照组，证明Rab27B确实能够影响肝癌细胞外泌体蛋白的分泌。　　接着，利用iTRAQ定量蛋白质组技术，首次构建Rab27B敲低前后肝癌细胞外泌体蛋白的差异表达谱。共鉴定到2716种蛋白质，基于等量外泌体蛋白计算，发现 Rab27B可影响外泌体蛋白组分的变化，其中26种蛋白质表达量与Rab27B正相关，42种蛋白质为负相关。基于等量细胞计算，发现Rab27B可影响外泌体蛋白的分泌量，其中277种蛋白质分泌量与Rab27B正相关，1种蛋白质为负相关。对Rab27B正相关外泌体蛋白进行生物信息学分析，发现定位于囊泡、质膜系统、细胞外基质及细胞表面等的蛋白质被显著富集；蛋白结合、细胞外基质结合、底物特异性转运活性及细胞表面结合等功能的蛋白质被显著富集；与细胞粘附、细胞移动、细胞运动及物质运输等生物进程相关的蛋白质被显著富集。信号通路分析结果显示，正相关蛋白显著富集于ECM-receptor interaction、Focal adhesion、Tight junction以及p53信号通路，主要参与细胞增殖、迁移以及细胞凋亡等过程的调控，与肿瘤转移密切相关。另外，发现 AGRIN、MOT4、FZD7、WNT11、CLD4、LPP1、LAMA5、TTI1等蛋白为Rab27B参与调控HCC转移提供了依赖于外泌体途径的候选下游分子。上述结果提示Rab27B通过调控与细胞粘附、运动以及迁移等功能相关的外泌体蛋白的分泌，影响HCC的转移。　　四、Rab27B非依赖于外泌体途径调控HCC转移的可能机制。　　利用iTRAQ定量蛋白质组技术，构建Rab27B敲低前后人肝癌细胞全蛋白的差异表达谱。共鉴定到4938种蛋白质，包括448种差异蛋白，其中表达量与Rab27B正相关的蛋白质有229种，负相关蛋白质有219种。亚细胞定位分析显示，差异蛋白主要定位于细胞核（189种）、细胞质（113种）以及胞外外泌体（108种）。富集分析结果显示，差异蛋白显著富集在细胞成分组装、细胞器组构、膜组构、囊泡运输、微管相关过程调控、细胞内定位、运输和细胞分裂等生物进程，以及异构酶活性、脱氨酶活性、辅因子结合、氧化还原酶活性、蛋白结合、水解酶活性、转移酶活性等分子功能。信号通路分析结果显示，有26种差异蛋白参与了8种肿瘤相关信号通路（Focal adhesion、MAPK、Wnt、ErbB、VEGF、细胞凋亡、Jak-STAT和p53信号通路），这些通路主要涉及细胞增殖、分化、迁移以及抗凋亡过程。其中Focal adhesion通路中的差异蛋白数最多，达到11种。上述数据表明，除影响外泌体分泌外，Rab27B还能通过胞内非依赖于外泌体的途径影响肝癌细胞的转移。　　五、MHCC97H细胞中潜在的Rab27B相互作用蛋白。　　我们通过IP-MS的方法，构建了人肝癌细胞MHCC97H中Rab27B相互作用蛋白谱，并从中筛选了可信度较高的候选蛋白分子，其中Focal adhesion通路中Src蛋白值得进一步实验验证。　　综上所述，本实验主要通过iTRAQ定量蛋白质组学技术，首次构建Rab27B敲低前后人肝癌细胞 MHCC97H所分泌的外泌体蛋白差异表达谱以及其胞内蛋白差异表达谱；并且通过IP-MS技术，发现潜在的Rab27B相互作用蛋白。分析结果显示，Rab27B与肝癌的发生发展正相关，其调控HCC转移的分子机制为：1.依赖于外泌体途径，通过影响外泌体蛋白的分泌量调控细胞粘附、运动以及迁移等行为；2.不依赖于外泌体途径，通过影响胞内重要信号通路来影响细胞增殖、分化、迁移以及抗凋亡过程。综合分析结果显示，Focal adhesion通路在Rab27B调控HCC转移过程中发挥重要作用。