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前言2型糖尿病确切的发病机制目前还不是十分清楚,但几乎所有的2型糖尿病病人都存在胰岛素抵抗(IR),甚至在正常的生理情况下,也会发生IR,如妊娠等。许多研究显示骨骼肌的胰岛素抵抗是和2型糖尿病相联系的重要缺陷之一胰岛素通过与胰岛素受体结合而发挥其生理效应,受体后异常即胰岛素信号转导的异常是导致胰岛素抵抗的重要原因。蛋白激酶B (protein kinase B, PKB)是由胰岛素调节的若干受体后信号转导因子之一,是胰岛素作用主要的信号转导途径之一磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)途径下游重要的丝氨酸／苏氨酸激酶,PKB能通过影响胰岛素的信号转导调节葡萄糖的摄取,糖原合成,糖酵解等胰岛素代谢反应。罗格列酮作为胰岛素增敏剂可以减轻IR,增加葡萄糖的摄入,但发挥作用的具体步骤不是十分清楚。LY294002是一种常用的PI3K途径抑制剂,可以通透细胞,特异性抑制PI3K,抑制PI3K／PKB信号途径。本研究应用棕榈酸诱导原代培养SD大鼠的四肢骨骼肌细胞形成胰岛素抵抗模型,检测该模型大鼠骨骼肌细胞在罗格列酮和LY294002分别作用后的胰岛素诱导下的PKB的蛋白表达及磷酸化情况,探讨罗格列酮是否通过该通路改善胰岛素敏感性。材料与方法在本项研究中,我们用胶原酶与胰酶双重消化的方法原代培养SD大鼠的胎鼠的骨骼肌细胞,运用差速贴壁法提纯细胞,采用形态分析及免疫荧光技术对细胞进行双重鉴定。然后用不同浓度的棕榈酸作用于该细胞,诱导后,用葡萄糖检测试剂盒(葡萄糖氧化酶法)测定培养液中葡萄糖的含量,分析后得到稳定的胰岛素抵抗模型。设立正常细胞组(NG),胰岛素抵抗细胞组(IR),罗格列酮干预组(RO),LY294002并罗格列酮干预组(RL)。分别按组别给予罗格列酮20gmol／L处理24h,10μmol／L浓度LY294002预处理24h等处理因素,处理后分别给予浓度为1×10-7mol／L的胰岛素孵育,孵育2、15、30分钟后,用western blotting方法检测PKB的蛋白表达及磷酸化情况。实验结果1、体外培养10天的成肌细胞由单核的长梭形细胞逐渐融合为多核的管状肌管,同向性排列生长,甚至出现可收缩的肌纤维；免疫荧光技术鉴定细胞,a-Sarcomeric Actin特异性抗体染色结果显示约96%的细胞胞浆呈阳性反应,细胞核外周及胞浆呈红色荧光,表明培养的细胞为骨骼肌细胞。2、0.6mM棕榈酸作用于正常培养条件下原代培养的大鼠骨骼肌细胞12-24h,能显著抑制骨骼肌细胞胰岛素刺激状态下的葡萄糖转运,表明此模型已经对生理剂量的胰岛素产生耐受,且这种抑制作用呈剂量-时间依赖。3、PKB蛋白表达RO组低于NG组,高于IR组,RL组低于RO组,但都无显著性意义。但是RO组PKB473位丝氨酸磷酸化水平较IR组明显升高(P<0.05),RL组PKB473位丝氨酸磷酸化水平较RO组明显降低(P<0.05)。结论1、用胶原酶与胰酶双重消化,差速贴壁法提纯可以得到状态良好并且纯度较高的原代培养骨骼肌细胞。2、0.6mM棕榈酸作用于正常培养条件下原代培养的大鼠骨骼肌细胞12-24h,可以形成稳定的胰岛素抵抗骨骼肌细胞模型。3、棕榈酸诱导的胰岛素抵抗骨骼肌细胞模型中,存在PKB的激活作用受损。罗格列酮增加胰岛素抵抗骨骼肌细胞敏感性的作用有PKB的参与,并且是通过上调骨骼肌细胞胰岛素信号转导系统PI3K途径中PKB 473位丝氨酸磷酸化水平来介导的。