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二化螟Chilo suppressalis(Walker),属鳞翅目,螟蛾科,在我国分布广泛,是最重要的水稻害虫之一,主要以钻蛀茎杆为害。本论文克隆了 9个二化螟20E合成通路基因的3’UTR,使用miRNA靶标预测软件预测了二化螟miRNA在20E合成通路3’UTR上的靶标位点,通过体外双荧光素酶报告基因实验进行了靶标验证,检测了 miRNA在二化螟5龄、6龄幼虫及蛹期的逐日表达谱。根据表达谱,选定合适的miRNA mimics注射时间点,观察注射后的表型变化,测定了二化螟血淋巴20E含量,揭示了 miRNA在二化螟变态发育中的功能。1、二化螟20E合成通路基因3’UTR的克隆使用RACE技术克隆了二化螟蜕皮激素合成通路中9个蛋白质编码基因的3’UTR,包括 csu-babo、csu-dib、csu-dsmad2、csu-erk、csu-nvd、csu-ptth、csu-punt、csu-ras、csu-shd。9个基因3’UTR的平均长度为526 bp,其中csu-ras基因3’UTR长度最长,为1043bp;csu-dib基因3’UTR长度仅为55 bp。2、二化螟miRNA在20E合成通路上的靶标预测利用 miranda、targetscan、RNAhybrid、microtar、PITA 等 5 个软件进行了 miRNA的靶标预测,选择了至少4个软件预测为靶标的结果,筛选出可作用于csu-nvd基因的靶标为 csu-miR-9b、csu-miR-239、csu-miR-241;可作用于csu-spok基因的csu-miR-bantam、csu-miR-024、csu-miR-80、csu-miR-89、csu-miR-124、csu-miR-154、csu-miR-257;可作用于csu-dib基因的csu-miR-260。预测结果显示,csu-spook基因被多达7个miRNA基因调控,这3个潜在的miRNA靶标基因都为Halloween基因,参与了蜕皮激素20E的合成。3、二化螟20E基因与miRNA的体外靶标验证通过体外双荧光素酶报告基因实验,验证了11个二化螟miRNA(csu-miR-8、csu-miR-9b、csu-miR-bantam、csu-miR-80、csu-miR-89、csu-miR-124、csu-miR-154、csu-miR-241、csu-miR-257、csu-miR-260)与 3 个二化螟20E 合成通路基因(csu-nvd、csu-dib、csu-spook)之间的靶标关系。结果表明,csu-miR-9b与csu-miR-241能够作用于csu-nvd基因,且csu-miR-9b的抑制作用更强,抑制率达50%;csu-miR-260作用于 csu-dib基因的 3’UTR,抑制率为 25%;csu-miR-bantam、csu-miR-80、csu-miR-89、csu-miR-154、csu-miR-257 均可作用于 csu-spook基因,抑制率分别为,40%,20%,15%,45%,55%。但是,csu-miR-124反而促进csu-spook基因的表达,显示为荧光信号增强。4、二化螟20E合成相关的miRNA在5龄、6龄幼虫及蛹期的表达谱利用定量 PCR 技术,检测了 7 个 miRNA,csu-miR-9b、csu-miR-bantam、csu-miR-80、csu-miR-89、csu-miR-154、csu-miR-257、csu-miR-260 在二化螟5、6 龄幼虫与蛹的逐日表达谱,结果表明各miRNA的表达量变化趋势差异明显。csu-miR-9b在5龄幼虫中表达最高,在蛹期最低;csu-miR-bantam、csu-miR-80在6龄幼虫中高表达,而csu-miR-89、csu-miR-154、csu-miR-257、csu-miR-260 在蛹期高表达。5、过表达二化螟20E合成相关的miRNA基因对化蛹的影响根据各miRNA在6龄到蛹期转换过程中的表达量,选取6龄第4天作为mimics注射的时间点。同时,根据miRNA的靶标,将注射分为三组:csu-miR-9b一组,靶标为 csu-nvd基因;csu-miR-260 一组,靶标为csu-dib基因;csu-miR-bantam、csu-miR-80、csu-miR-89、csu-miR-154、csu-miR-257 一组,靶标为csu-spook基因。结果表明,三组mimics注射都导致了死亡率上升、化蛹率下降、化蛹延迟和血淋巴20E滴度下降。显示这些miRNA分别作用于各自靶标基因,抑制二化螟20E信号通路的信号传递,阻断20E的合成途径,导致二化螟血淋巴中20E含量的降低,从而抑制二化螟的变态发育。其中,csu-miR-bantam、csu-miR-80、csu-miR-89、csu-miR-154、csu-miR-257五个miRNA共同靶向csu-spook基因,发挥了miRNA基因的联合作用。