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背景:驱虫斑鸠菊为菊科斑鸠菊属一年生草本植物驱虫斑鸠菊Vernonia anthelmintica(L.)Willd.的成熟果实,是维吾尔族常用药。具有激活酪氨酸酶活性、提高黑色素合成能力、抗肿瘤、调节免疫及补充微量元素等功能,主治白癜风、湿寒性炎肿和肠道寄生虫。近年来,国内学术界对驱虫斑鸠菊的研究主要围绕其临床应用展开,而对于其活性成分及药理作用机制尚不清楚。因此,本课题对驱虫斑鸠菊的化学成分进行了系统的研究,并对分离的单体化合物进行酪氨酸酶激活、抗氧化及抗肿瘤三个方面的活性评价,结果发现异鼠李素和木犀草素能显著抑制胰腺癌PANC-1细胞的增殖,但异鼠李素抗胰腺癌的作用机制尚未见文献报道。目的:通过提取分离技术与液质联用技术对驱虫斑鸠菊的化学成分进行深入的研究,然后对分离的单体化合物进行含量测定、药理活性评价及作用机制研究,旨在为驱虫斑鸠菊进一步研究奠定基础。方法:1.驱虫斑鸠菊化学成分研究:采用硅胶、Sephadex LH-20和制备液相等分离技术,对驱虫斑鸠菊的乙酸乙酯部位进行化学成分的系统分离。利用质谱和核磁共振等分析技术进行单体化合物的结构解析。同时,运用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS技术分析总结黄酮和咖啡酰基奎宁酸这两类多酚类化合物的质谱裂解规律,并将此规律应用到驱虫斑鸠菊乙醇提取物中多酚类化合物的快速识别。2.驱虫斑鸠菊药材含量测定方法研究:建立同时测定驱虫斑鸠菊中圣草酚、紫铆查耳酮、紫铆素和异鼠李素4个黄酮类成分含量的HPLC法。色谱条件为:采用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,以乙腈为流动相A,0.2%磷酸水溶液为流动相B,进行梯度洗脱,检测波长310nm,流速1.0mL·min-1,柱温25℃。3.驱虫斑鸠菊中多酚类化合物药理活性评价:采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法考察驱虫斑鸠菊中7个黄酮类化合物对酪氨酸酶的激活作用;运用DPPH法评价驱虫斑鸠菊中9个多酚类化合物的体外抗氧化活性;运用CCK-8法筛选驱虫斑鸠菊中9个多酚类化合物对人胰腺癌(PANC-1)和结直肠癌(LoVo)细胞株的增殖抑制活性。4.异鼠李素抗胰腺癌的作用机制研究:应用Hoechst 33258荧光染色和Annexin V-FITC/PI双染法检测PANC-1细胞凋亡情况;运用流式细胞仪测定PANC-1细胞周期分布;采用Western blot检测周期相关蛋白及RAS/MAPK信号通路相关蛋白的表达;利用qRT-PCR试验技术检测细胞周期相关基因mRNA的水平;并通过划痕实验检测PANC-1细胞迁移能力。结果:1.从驱虫斑鸠菊的乙酸乙酯部位共分离得到14个单体化合物,其中包括7个黄酮,4个酚酸,2个吲哚类生物碱及1个甾醇类化合物。单体成分为:N-乙酰基吲哚-3-甲醛(1)、1-乙基吲哚-3-甲酸(2)、豆甾醇(3)、圣草酚(4)、芹菜素(5)、紫铆查尔酮(6)、紫铆素(7)、异鼠李素(8)、硫黄菊素(9)、木犀草素(10)、咖啡酸(11)、原儿茶酸(12)、3,5-二咖啡酰奎宁酸甲酯(13)、3,4-二咖啡酰奎宁酸甲酯(14)。其中,化合物12～14为首次从该植物中分离得到,化合物1～2、9为首次从该属植物中分离得到,且生物碱类成分为首次从该植物中发现。通过UPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS技术,从驱虫斑鸠菊乙醇提取物中共鉴定出43个多酚类成分,其中包括13个酚酸类和30个黄酮类,且有26个单体成分为首次在该植物中报道。2.通过考察提取物的提取方法、检测波长及流动相比列,首次建立了一种HPLC法同时测定驱虫斑鸠菊中4个黄酮类成分含量的方法。结果表明,圣草酚、紫铆查耳酮、紫铆素和异鼠李素的进样量分别在13.44～107.52、30.24～241.92、9.60～76.80、6.25～49.97 ng范围内与峰面积积分值呈良好线性关系,r分别为0.9998、0.9999、0.9991、0.9997,平均加样回收率(n=9)在99.70%～100.56%,RSD小于2.0%。本法简单、快速、重现性好,可为评价驱虫斑鸠菊药材的质量提供依据。3.蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法结果表明,从驱虫斑鸠菊中分离的7个黄酮类化合物对酪氨酸酶均没有激活作用,反而对其具有较好的抑制活性,提示这7个黄酮类化合并不能通过激活酪氨酸酶活性来促进黑素合成。DPPH法实验结果表明,驱虫斑鸠菊中9种多酚类化合抗氧化能力存在显著差异,其中3,5-二咖啡酰奎宁酸甲酯、3,4-二咖啡酰奎宁酸甲酯、木犀草素、异鼠李素及紫铆查耳酮的抗氧化能力均强于抗坏血酸(VC),且以两个咖啡酰基奎宁酸类成分活性最强,这种差异与它们本身的结构有关。CCK-8法实验结果表明,驱虫斑鸠菊中9个多酚类化合物,仅有异鼠李素和木犀草素以剂量依赖的方式显著抑制胰腺癌PANC-1细胞的增殖,且半数抑制浓度分为19.6 μM和18.1 μM。4.细胞凋亡实验结果表明,异鼠李素对PANC-1细胞核形态没有影响,但能显著抑制PANC-1细胞的早期凋亡,且对晚期凋亡有微弱的促进作用。细胞周期实验结果表明,异鼠李素可显著诱导PANC-1细胞发生S期阻滞,其主要通过激活Cyclin E-CDK2复合物的活性并下调CyclinA蛋白的表达来抑制PANC-1细胞S期进展。同时,异鼠李素可以从转录水平下调Cyclin A蛋白的表达,但并不能从转录水平调控Cyclin E、CDK2蛋白的表达。免疫印迹法实验结果表明,异鼠李素以剂量依赖的方式显著抑制MEK蛋白的磷酸化,但对ERK蛋白的磷酸化仅有微弱的抑制活性。划痕实验结果表明,异鼠李素可显著抑制人胰腺癌PANC-1细胞的迁移,且在高浓度时,几乎完全抑制其迁移活性。结论:通过对驱虫斑鸠菊化学成分的系统分离与分析,建立了该植物中多酚类成分快速识别的方法,为驱虫斑鸠菊药材的药效物质基础研究奠定基础;通过指标成分的选择,建立了驱虫斑鸠菊药材含量测定的方法,为驱虫斑鸠菊药材质量控制研究提供实验依据;驱虫斑鸠菊中分离得到的异鼠李素可以显著抑制人胰腺癌PANC-1细胞增殖,其作用机制主要包括诱导细胞凋亡、调控周期相关蛋白使细胞S期阻滞及抑制RAS/MAPK信号通路的激活。