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玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN,ZEA),是一种由镰刀菌属产生并释放到环境中的类雌激素真菌毒素,主要来自于霉变的玉米。ZEN的二羟基苯甲酸内酯结构使其具有雌激素活性,能引起人和动物雌激素过多综合症,其滋长不仅给种植业和畜牧业带来了严重的经济损失,也对人类健康构成了严重的威胁。目前,为防止ZEN污染,国内外学者积极研究了各种ZEN脱毒方法,包括物理法,化学法及生物脱毒法等。普通吸附效率低,易吸附其他营养物质;化学法对其他营养破坏明显,易带来环境污染。因此,生物法成为研究热点。课题组已成功分离得到一株不动杆菌Acinetobacter sp.SM04,能高效降解ZEN生成极低雌激素活性的代谢产物,从SM04分离出两种关键作用酶,过氧化物酶A4-Prx在30°C处理12 h后ZEN降解率达78.44%。本论文主要研究第二种非过氧化物酶A4-Oxa,通过设计简并引物P1、P2从SM04中扩增A4-Oxa的编码基因,通过基因工程方法将目的基因插入表达载体pPIC9K中,转入Escherichia coli DH5α,成功构建重组质粒pPIC9K-Oxa;构建重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-Oxa,获得胞外蛋白表达量为1295.28μg/mL,其中A4-Oxa约为155.43μg/m L,蛋白分子量约为38 kDa,在40°C下作用ZEN 12 h后的降解率达53.41%。本论文对重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-Oxa的诱导表达进行优化。发现以BMMY培养基为基础,添加0.1%甘氨酸,1 mmol/L EDTA,2%甲醇,在30°C振荡培养72 h(180 r/min),可获得220.50μg/m L的重组蛋白,较对照组提高了20.06%,40°C下作用ZEN 12 h后的降解率达66.31%。本论文对不同ZEN浓度下的降解产物进行MCF-7细胞增殖检测。结果显示,当ZEN浓度为20μg/m L时,降解反应前对MCF-7细胞的增殖率为28.3%,作用6 h后A4-Oxa粗酶液对ZEN的降解率为50%,降解产物对MCF-7的细胞增殖率为12.3%,降解产物的雌激素毒性显著降低;对产物的有机相萃取后,TLC和HRMS均未检出新的产物生成,证明产物不在有机相中。本论文对A4-Oxa的相关特性进行了研究:当温度从40°C升至80°C时,重组蛋白A4-Oxa对ZEN的降解率从33.21%提高到56.12%;当pH从7.0升高至11.0时,重组蛋白A4-Oxa对ZEN的降解率从19.63%提高到51.87%。实验证明,上清液中残留菌体对ZEN有少量吸附作用,高温80°C或高pH 11.0是无法让ZEN发生任何降解的,该重组A4-Oxa酶可在高温高pH的条件下发挥催化作用,这在将来需要更多的实验进行验证和研究。