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目的:近期发现长寿蛋白SIRT1可改善肥胖大鼠的胰岛素敏感性,降低血糖,改善动脉粥样硬化。但SIRT1改善糖尿病的机制未明,其是否参与了2型糖尿病及其大血管并发症的发生发展尚缺乏深入的研究。本研究以高糖培养原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为研究对象,研究SIRT1在其损伤中的作用及可能的机制。方法:0.25%胰蛋白酶灌注消化法分离HUVEC细胞。取生长良好的第2~3代细胞用于实验。实验分4个部分。第1部分:高糖对内皮细胞SIRT1表达及内皮细胞功能指标的影响。培养细胞分为正常对照组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖培养组(33.3mmol/L葡萄糖)、甘露醇高渗对照组(5.5 mmol/L葡萄糖+27.8 mmol/L甘露醇)。细胞处理48小时。应用RT-PCR法检测SIRT1、E-选择素、eNOS、内皮素-1基因的表达情况,以Western印迹法检测培养细胞SIRT1的蛋白水平,以硝酸还原酶法检测培养细胞上清中NO的含量。第2部分:SIRT1激动剂白藜芦醇对高糖处理内皮细胞功能指标的影响。细胞分为正常对照组、高糖组、1μmol/L白藜芦醇预处理24小时+高糖组。高糖处理48小时。分析指标及方法同第一部分。第3部分:白藜芦醇对SIRT1基因“沉默”后高糖处理内皮细胞功能指标的影响。细胞分5组:正常对照组、高糖组、白藜芦醇预处理+高糖组、SIRT1 siRNA+白藜芦醇预处理+高糖组、Lipo 2000+白藜芦醇+高糖组(空载体组)。前3组细胞处理同第2部分。SIRT1 siRNA组细胞以Lipofectamine 2000脂质体为载体转染1 6.7 nmol/LSIRT1 siRNA入内皮细胞,以干扰内皮细胞SIRT1的表达,干扰后6小时更换为正常培养液,24小时后进行后续的白藜芦醇和高糖处理。空载体组单纯以Lipofectamine 2000脂质体处理内皮细胞,其余处理同SIRT1 siRNA组。分析指标及方法同第一部分。第4部分:白藜芦醇对高糖处理内皮细胞胰岛素抵抗的影响。培养细胞分为对照组、胰岛素处理组、高糖组+胰岛素处理组、1μmol/L白藜芦醇预处理24小时+高糖+胰岛素处理组。高糖处理48小时。后3组细胞以100 nmol/L胰岛素刺激30 min。检测上清中内皮细胞NO分泌含量。结果:(1)与正常对照相比,高糖培养48小时使内皮细胞SIRT1的mRNA及蛋白表达均降低(P<0.05);内皮细胞eNOS mRNA的表达及NO分泌降低(P<0.01);而反映内皮细胞损伤的因子如E-选择素及内皮素-1的表达却明显升高(P<0.05)。甘露醇组与正常对照相比没有显著差异。(2)与高糖组相比,1μmol/L白藜芦醇预处理24小时明显升高高糖处理内皮细胞SIRT1的表达水平(P<0.01);同时内皮细胞eNOS的表达(P<0.05)、NO分泌均明显升高(P<0.01);E-选择素、内皮素-1明显降低(P<0.05)。(3)与单纯白藜芦醇处理组相比,SIRT1 siRNA组细胞SIRT1的mRNA及蛋白水平均显著降低(P<0.05),SIRT1蛋白表达的干扰效率为45.9%;内皮细胞的eNOS表达、NO的分泌明显降低(P<0.05),与高糖处理组没有差异,提示随SIRT1的表达“沉默”白藜芦醇促进eNOS表达、NO分泌的作用“消失”;内皮素-1的表达没有变化(P>0.05),均显著低于高糖组,提示随SIRT1的表达“沉默”白藜芦醇对内皮素-1的抑制作用不受影响;E-选择素的表达明显升高(P<0.05),与高糖处理组差异不明显,提示随SIRT1的表达“沉默”白藜芦醇对E-选择素的抑制作用也“消失”。空载体组与白藜芦醇处理组相比各指标无明显差异。(4)100 nmol/L胰岛素处理30 min明显刺激内皮细胞NO的分泌。高糖使内皮细胞胰岛素刺激的NO分泌降低,产生了内皮细胞胰岛素抵抗。但是白藜芦醇预处理可以明显促进高糖培养内皮细胞胰岛素刺激的NO分泌。P均<0.01。结论(1)SIRT1通过促进eNOS表达及刺激NO分泌而具有舒张血管的作用,还通过抑制E-选择素的表达降低白细胞对内皮细胞的黏附。SIRT1的表达降低在高糖诱导的血管内皮细胞损伤中具有重要作用,SIRT1激动剂可保护内皮细胞不受高糖的影响,因而在预防和治疗糖尿病大血管病变中具有广阔的前景。(2)白藜芦醇可通过促进SIRT1的表达而具有促进高糖培养内皮细胞eNOS表达、NO分泌及降低E-选择素表达的作用。白藜芦醇还具有抑制内皮细胞内皮素-1表达的作用,且该作用与SIRT1无关。白藜芦醇还具有改善高糖环境下内皮细胞胰岛素抵抗的作用。因此,白藜芦醇在预防和治疗糖尿病大血管病变中具有广阔的前景。