第一部分稳定表达绿色荧光蛋白的Buffalo大鼠肝癌模型相关特性的评价目的：建立稳定表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的Buffalo大鼠肝癌移植瘤模型,评价该模型的肿瘤生长、转移及循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)等特点,并研究其影像学表现,为肝癌的转移与复发、介入治疗及影像学诊断等研究提供一个理想的动物模型。方法：将McA-RH7777/EGFP细胞株皮下注射成瘤后,制备瘤块。开腹直视下,接种于30只Buffalo大鼠肝脏及10只大鼠大腿根部皮下。观察荷瘤鼠的生物学特征变化及转移特性。行多普勒超声、MRI、CT、DSA、PET-CT检查评价该模型的影像学特点。荧光显微镜下观察绿色荧光表达的稳定性并评价荧光在肿瘤转移与治疗研究中的优势。流式细胞仪检测对比肝癌原位瘤与皮下瘤模型CTCs数量的差异,接种28天后处死动物观察两组肺转移率的差异。结果：肝癌原位瘤与皮下瘤模型造模成功率高,达到100%。终末期观察该肝癌原位瘤模型具有高肺转移特性,肿瘤组织荧光表达稳定。多普勒超声可见肿瘤呈结节状圆形或类圆形病灶,病灶略高回声,边界清楚。MRI扫描肿瘤T1WI成像呈稍低或等信号,T2WI呈高信号,DWI亦呈高信号,边界清楚,但病灶增大后T2WI为混杂信号。CT显示肝内病灶为低密度,转移瘤好发于双肺周围,单发转移瘤呈类圆形,边界清楚；多发转移瘤,大小不一,部分病灶融合成团块。DSA造影显示肝内肿瘤供血动脉增粗,血管扭曲,肿瘤染色明显,碘油灌注后沉积于病灶处：门静脉造影未见明显供血,碘油灌注后病灶内亦无碘油沉积。PET-CT提示原位瘤葡萄糖代谢增高,中央坏死区无葡萄糖代谢。荧光显微镜可以敏感地观察到肺部微小转移灶,并可清楚显示肿瘤供血动脉,能动态观察微波消融中病灶绿色荧光的强度逐渐变弱至消失的变化过程。与皮下瘤模型比较,在相同的时间点原位瘤模型CTCs数量较多,其肺转移瘤率也较高。结论：稳定表达EGFP的Buffalo大鼠肝癌模型具有成瘤率高、重复性强、高肺转移等特性。其生物学特性及影像学特点与人类的肝癌接近,荧光表达稳定且敏感,能早期准确地发现转移灶及CTCs,非常适合于肝癌转移和复发、介入治疗及影像学诊断等方面的实验研究。第二部分经动脉栓塞术通过增加循环肿瘤细胞促进肝癌肺转移的实验研究目的：探讨经动脉栓塞治疗大鼠移植性肝癌对肺转移的影响,并对循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)数量的影响进行初步研究。方法：取42只Buffalo大鼠,开腹直视下,将瘤块种植到大鼠肝脏左叶,建立稳定表达绿色荧光蛋白的大鼠肝癌模型。造模后第14天,将大鼠随机分成2组,每组21只,开腹胃十二指肠动脉逆行插管成功后,对照组(Control)注入生理盐水(0.6ml/kg),栓塞组(TAE)注入超液化碘油(0.2m I/kg)。术后随访体重及肿瘤体积变化。术后2周每组各处死15只大鼠,收集肝和肺标本,观察肝内转移及肺转移情况。组织HE染色及透射电镜观察栓塞对肝癌局部侵袭的影响。通过进行流式细胞仪检测比较两组术后各时间点CTCs数量的差异。结果：对照组及栓塞组两组大鼠术前体重接近,术后21天时体重分别为217.30±10.59 g及233.40±6.13 g,P<0.05。术后第7、14天,记录肝内肿瘤情况显示栓塞组明显抑制肝脏肿瘤生长。术后14天,两组肝内及肺部转移率无明显差异,但栓塞组肺转移灶个数明显多于对照组。HE病理检查见栓塞组肿瘤细胞突破包膜,边界模糊：侵犯血管,形成癌栓。透射电镜检查可见栓塞组肿瘤细胞侵犯血管、肿瘤细胞游走、肿瘤细胞侵入正常肝组织及基底膜不完整等征象。对照组与栓塞组的CTCs数量在手术当天(0天)和术后第1、3天无显著差异,而后CTCs的数量逐渐增多,且栓塞组明显多于对照组。第7天分别为(51.80±7.02)/106及(72.93±11.08)/106,P<0.05；第14天时分别为(92.73±13.66)/106及(189.20±28.80)/106, P<0.05；第21天时分别为(285.33±48.62)/106及(592.50±90.86)／106,P<0.05。结论：在大鼠肝癌模型上,经动脉碘油栓塞能抑制肿瘤生长,但通过增加CTCs数量促进残癌肺转移。第三部分上皮间质转化是经动脉栓塞后循环肿瘤细胞增加的重要机制目的：研究经动脉栓塞后循环肿瘤细胞增加的分子机制。方法：以1OOumol/L CoCl2模拟体外缺氧环境培养McA-RH7777/EGFP肝癌细胞,观察其形态改变,Transwell小室评价其侵袭力的改变,免疫荧光和real time PCR检测缺氧环境下McA-RH7777/EGFP细胞EMT相关分子表达的改变。通过进行Western-blot、免疫组化检测第二部分对照组及栓塞组肝癌肿瘤组织中的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达的差异。使用流式细胞仪检测CTCs与McARH-7777/EGFP细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达的差异。结果：缺氧培养24h后McA-RH7777/EGFP肝癌细胞出现间质形态学改变,体外侵袭能力增强。Transwell实验提示缺氧组31.4±6.8 vs常氧组19.3±3.3(P<0.05)。免疫荧光染色证实：与McA-RH7777/EGFP细胞比较,CoCl2-McA-RH777/EGFP细胞上皮分子E-cadherin表达降低,而Vimentin、 N-cadherin等间质分子表达显著上调。通过RT-PCR比较常氧与缺氧HIF-1α及EMT相关指标mRNA的相对表达量分别为：0.40±0.04 与 1.64±0.06(HIF-1α, P<0.05),0.92±0.10 与0.52±0.07 (E-cadherin, P<0.05),0.55±0.28 与 1.21± 0.30 (N-cadherin, P<0.05),0.87±0.14 与 1.25±0.29 (Vimentin, P<0.05)。将对照组与栓塞组肝癌标本进行Western-blot分析HIF-1α、E-cadherin、 N-cadherin 及 Vimentin的表达,分别为：0.21±0.11、0.79±0.14；0.74±0.21、0.39±0.17；0.20±0.08、0.35±0.10及0.49±0.10、0.75±0.12；差异均有统计学意义,P<0.05。免疫组化染色记录阳性细胞数百分比显示对照组与栓塞组HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin 及 Vimentin的表达分别为43.33±11.13、81.33±9.72；33.33±7.24、13.00±7.27；42.00±8.62、71.33±9.16及54.00±9.86、82.00±9.41,差异均有统计学意义,P<0.05。流式细胞仪检测CTCs与McA-RH7777/EGFP细胞表达E-cadhe N-cadherin 及 Vimentin,阳性表达率分别为：36/156(23.1%)vs 127/215(59.86/199(43.1%)vs 14/179(7.8%)及75/137(52.6%)vs 21/207 (10.1%异均有统计学意义,P<0.05。结论：缺氧诱导肝癌细胞发生EMT是TAE后CTCs增加的重要机制。±9.41,差异均有统计学意义,P<0.05。流式细胞仪检测CTCs与McA-RH7777/EGFP细胞表达E-cadhe N-cadherin 及 Vimentin,阳性表达率分别为：36/156(23.1%)vs 127/215(59.86/199(43.1%)vs 14/179(7.8%)及75/137(52.6%)vs 21/207 (10.1%异均有统计学意义,P<0.05。结论：缺氧诱导肝癌细胞发生EMT是TAE后CTCs增加的重要机制。第四部分肝动脉化疗栓塞术对中晚期原发性肝癌患者血中循环肿瘤细胞的影响及其临床意义目的：用免疫磁珠分选的方法检测中晚期原发性肝癌患者外周血(peripheral blood,PB)及右心房血(right atrium blood, RAB)中上皮特异性细胞粘附分子(epithelial cellular adhesion molecule, EpCAM) 阳性循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs),比较外周血及右心房血中CTCs的差异,评价肝动脉化疗栓塞术(transarterial chemoembolization, TACE)是否导致肿瘤细胞脱离。并寻找术前、术后外周血及右心房CTCs的最佳界值,评价其对早期疾病进展的预测价值及对至疾病进展时间(time to progress, TTP)的影响。方法：42例符合入选标准的初治中晚期原发性肝癌患者于TACE术前及术后即刻分别采集外周及右心房血样各7.5ml,应用EpCAM抗体偶联纳米磁珠对循环血中的CTCs进行阳性富集及分离。CTCs≥1个即定义为CTCs阳性。分别计算各标本CTCs的阳性率及数量,比较TACE术对原发性肝癌患者外周及右心房血中CTCs的影响,并比较两位置间CTCs的差异。入组TACE术后3个月以内肿瘤出现进展我们定义为早期疾病进展(early progress, EP)。肿瘤介入术后的疗效按照mRECIST标准评价。肝内病灶进展或肝外转移定义为研究终点。运用受试者工作特征曲线(ROC)评估CTCs预测早期疾病进展的价值并确定诊断最佳临界值,计算曲线下面积(AUC)。使用Logistic回归分析筛选原发性肝癌患者早期疾病进展的预测因素。Cox风险比例模型分析影响原发性肝癌患者TTP的危险因素。通过Kaplan-Meier分析CTCs数量与TIP的关系,并以log-rank进行检验。结果：42例肝癌患者的外周血中,术前CTCs阳性者22例(52.4%),术后CTCs阳性者27例(64.3%),P=0.267。右心房术前CTCs阳性者31例(73.8%),术后CTCs阳性者35例(83.3%),P=0.219。术前及术后右心房CTCs的阳性率均高于外周(分别为P=0.012及P=0.039)。术前外周血CTCs的数量范围为0～30个,术后范围为0～54个,P=0.166；术前右心房CTCs的数量范围为0-65个,术后范围为0-98个,P=0.102。术前、术后外周与右心房CTCs数目比较差异有统计学意义(分别为P=0.007及P=0.021)。早期疾病进展组(EP)与非早期疾病进展组(No EP)TACE术前外周血CTCs均值分别为9.8个及2.2个,P=0.028；右心房血分别为25.0个及7.6个,P=0.003。TACE术后外周血CTCs均值分别为13.1个及2.9个,P=0.002；右心房分别为27.2个及9.6个,P=0.015。单因素Logistic回归分析对预测早期疾病进展有价值的因素为术前外周CTCs(>5个)、术后外周CTCs(>7个)、术前右心房CTCs(>9个)及术后右心房CTCs(>12个)。多因素Logistic回归分析发现术前右心房CTCs的个数>9个是早期疾病进展独立的预测因子。其AUC(曲线下面积)为0.838±0.075。Cox风险比例模型进行分析术前右心房CTCs>9个[(95%CI)为5.124(1.185-22.162)]为影响原发性肝癌患者TTP的独立影响因子。结论：HCC患者右心房血CTCs的含量比外周血更高,TACE术后即刻并未导致外周血及右心房CTCs阳性率及数量显著改变。术前右心房CTC的个数>9个是TTP独立的影响因子,并对早期疾病进展有预测价值。