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目的观察电针联合丰富康复训练对脑缺血损伤的效应,探讨其调控Nogo信号通路RhoA、ROCK蛋白干预神经再生的可能机制。方法取健康大鼠(雄性,清洁级SD大鼠)90只,其中假手术组18只,将造模成功后的SD大鼠采用随机分组法分入模型组、电针组、丰富康复组、针康组(电针联合丰富康复训练组)四组。本实验所需大鼠脑缺血模型,采用线栓法构建。模型组、假手术组未干预,电针组:电针进行干预,丰富康复组:康复技术(负趋地性、挂线、胶粘剂去除训练)与丰富环境联合干预,针康组:上述干预手段联合干预。五组处死动物取材的时间点分别为:干预3、7、14d。干预1、3、7、14d使用神经功能缺损评分(NDS)观察各组大鼠神经功能缺损程度;干预1、3、7、14d使用行为学检测试验观察各组大鼠功能改善的程度;取材后TTC染色,测量各组不同时间段大鼠的脑梗死体积;对各组大鼠干预14d缺血侧的皮质和海马进行HE染色法,观察其组织学的变化;分别使用三种(免疫组织化学法、Westen blot、RT-PCR)检测各组干预14d大鼠缺血侧皮质和海马的Nogo信号通路中RhoA、ROCK的表达情况。结果1.NDS在干预1、3、7、14d四个时间点对五组实验大鼠进行NDS,结果如下:假手术组术后四个时间点大鼠的NDS均为0分;模型组各个时间点的NDS均高于假手术组,有统计学意义(P<0.01);干预1、3d,三干预组NDS比模型组均有降低,但无统计学意义(P>0.05);干预7、14d,模型组NDS均显著高于三干预组,有统计学意义(P<0.05或P<0.01);同针康组比较,其他二组干预组的NDS均高于针康组,组间差异有统计学意义(P<0.01)。2.行为学功能评分(1)负趋地性检查在干预1、3、7、14d四个时间点对各组大鼠进行负趋地性实验评定,结果如下:与假手术组术后四个时间点的负趋地性所需时间相比较,模型组各时间点的负趋地性所需时间均显著长于假手术组所需时间,组间差异有统计学意义(P<0.01);干预1、3d,三干预组的负趋地性所需的时间均短于模型组,但组间差异无统计学意义(P>0.05);干预7、14d,各干预组的负趋地性的时间均显著短于模型组所需的时间,有统计学意义(P<0.05或P<0.01);丰富康复组所用时间比电针组少,但两组间差异无统计学意义(P>0.05);针康组所需的时间低于丰富康复训练组,有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。(2)挂线测试在干预1、3、7、14d四个时间点对各组实验大鼠进行挂线测试评定,结果如下:假手术组术后术后四个时间点大鼠的前肢停留在线上的时间与假手术组相比较,模型组各个时间点的前肢停留在线上的时间均显著低于假手术组,有统计学意义(P<0.01);干预1d,三干预组前肢停留在线上的时间均长于模型组,但无统计学意义(P>0.05);干预3、7、14d,模型组停留时间均显著长于各干预组挂线所需用时间,有统计学意义(P<0.01);其他两干预组前肢停留在线上的时间均显著长于电针组所需时间,有统计学意义(P<0.01);针康组挂线停留时间显著短于丰富康复训练组,有统计学意义(P<0.05)。(3)胶粘剂去除试验干预1、3、7、14d四个时间点对各组大鼠进行胶粘剂去除试验评定,结果如下:与假手术组老鼠术后个时间点大鼠的胶粘剂去除试验所需时间相比较,模型组各个时间点的所需时间均显著长于假手术组,有统计学意义(P<0.01);干预1,3d,三干预组胶粘剂去除试验所需时间均短于模型组所需时间,但无统计学意义(P>0.05);干预7、14d,各干预组胶粘剂去除试验所需时间均显著低于模型组,有统计学意义(P<0.01);其他二组干预组胶粘剂去除试验所需时间均显著短于电针组所需时间,有统计学意义(P<0.05,P<0.01);针康组胶粘剂去除试验所需时间显著短于丰富康复训练组,有统计学意义(P<0.05)。3.梗死体积检测TTC染色后,苍白色为大鼠缺血区。缺血区与正常组织的界限不模糊,能够区分正常与缺血的界限,额、顶、颞叶以及基底节区可出现梗死。假手术组无苍白色区域;模型组有明显的苍白区;干预3d,各干预组与模型组比较,模型组苍白区的体积均较前者大,但苍白区的体积的差异无统计学意义(P>0.05);干预7、14d,三干预组与模型组比较,模型组苍白区的体积均较前者大,且苍白区的体积差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);针康组苍白区的体积与其他两组干预组相比有所减小,有统计学意义(P<0.05)。4.组织学观察通过HE染色,光镜下观察发现:假手术组的皮层和海马区神经元形态很少有异常,组织层次清楚;模型组的神经元水肿,细胞紊乱排列,部分神经元呈现空泡样变化,核固缩,甚至出现核仁消失。三干预组,干预14d皮层和海马区神经元相应病理变化均较模型组有所减轻。针康组同其他干预组相比,干预14d大鼠缺血侧的皮质和海马区周围炎性浸润减轻更明显,且有较多的神经元,较少打的异常神经元。5.RhoA和ROCK蛋白的表达(1)皮质区免疫组化:通过免疫组化技术发现,脑缺血后缺血侧皮层RhoA和ROCK2阳性细胞数明显增高,假手术组可见RhoA和ROCK2阳性细胞数较少。模型组RhoA和ROCK2阳性细胞数显著高于假手术组,有统计学意义(P<0.01)。模型组RhoA和ROCK2阳性细胞数显著高于三干预组,有统计学意义(P<0.01)。针康组RhoA和ROCK2阳性细胞数显著低于其他两干预组,有统计学意义(P<0.01)。Westen blot:通过Westen blot技术发现,脑缺血后缺血侧皮RhoA和ROCK2明显增强,假手术组可见RhoA和ROCK2少量的表达。模型组RhoA和ROCK2显著强于假手术组,有统计学意义(P<0.01)。模型组RhoA和ROCK2均显著强于三干预组,有统计学意义(P<0.01)。与其他二组干预组比较,针康组RhoA和ROCK2显著低于这两组干预组,有统计学意义(P<0.01)。(2)海马区免疫组化:通过免疫组化技术发现脑缺血后缺血侧海马RhoA和ROCK2阳性细胞数明显增高,假手术组可见RhoA和ROCK2的阳性细胞数较少。模型组RhoA和ROCK2阳性细胞数显著高于假手术组,有统计学意义(P<0.01)。模型组RhoA和ROCK2阳性细胞数均显著强于三干预组,有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。其他两干预组RhoA和ROCK2阳性细胞数著高于针康组,有统计学意义(P<0.01)。Westen blot:通过Westen blot技术发现脑缺血后缺血侧海马RhoA和ROCK2表达明显增强,假手术组可见RhoA和ROCK2少量的表达。模型组RhoA和ROCK2表达显著强于假手术组,有统计学意义(P<0.01)。模型组RhoA和ROCK2表达均显著强于三干预组,有统计学意义(P<0.01)。其他两干预组RhoA和ROCK2表达强于针康组,有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。6.RhoA和ROCK基因的表达(1)皮质区通过RT-PCR检测技术发现,脑缺血后缺血侧皮层RhoA和ROCK2 mRNA明显增高,假手术组可见RhoA和ROCK2 mRNA少量表达。模型组RhoA和ROCK2 m RNA显著强于假手术组,有统计学意义(P<0.01)。模型组RhoA和ROCK2 mRNA表达均显著强于三干预组,有统计学意义(P<0.01)。其他两干预组RhoA和ROCK2 m RNA表达显著强于针康组,有统计学意义(P<0.05)。(2)海马区通过RT-PCR检测技术发现脑缺血后缺血侧海马RhoA和ROCK2 mRNA的表达明显增强,假手术组可见RhoA和ROCK2 mRNA少量的表达。模型组RhoA和ROCK2 mRNA表达显著强于假手术组,有统计学意义(P<0.01)。模型组RhoA和ROCK2 mRNA表达强于三干预组,有统计学意义(P<0.01)。与其他两干预组RhoA和ROCK2 mRNA表达强于针康组,有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论1.同电针或丰富康复治疗相比,二者的联合治疗能够更有效的改善局灶性脑缺血后大鼠神经功能,增强肢体协调性和平衡能力。2.同电针与丰富康复治疗相比,二者的联合治疗能够减小脑缺血大鼠梗死体积减轻脑组织的病理改变。3.电针联合丰富康复训练能够下调大鼠缺血区皮层和海马中Nogo信号通路RhoA、ROCK2表达,这可能是针康法促进脑缺血后神经功能重塑的相关机制之一。