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百草枯(Paraquat,PQ)中毒是发展中国家急性中毒患者死亡的主要原因。肺是其主要靶器官,PQ中毒后,迅速在肺内积聚,导致肺泡上皮细胞渗透性增加,肺出血、水肿,引起急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合症,进一步发展为肺纤维化,肺纤维化是PQ中毒导致死亡的主要原因。PQ中毒没有特殊解毒药物,因此研究百草枯导致的肺纤维化的机制具有重要意义。肺纤维化的主要病理特征是肺泡结构破坏,功能丧失,成纤维细胞和肌成纤维细胞增殖及细胞外基质沉积(extracellular matrix,ECM)。在肺纤维化的过程中,分泌细胞外基质的主要是肌成纤维细胞。肌成纤维细胞主要有3个来源,间质内的成纤维细胞转化成肌成纤维细胞;骨髓干细胞转化为肌成纤维细胞;肺泡上皮细胞向间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)。研究表明EMT是肺纤维化中肌成纤维细胞的重要来源,目前大量的实验关注EMT在纤维化疾病中的研究。在ECM的沉积中起重要作用的是赖氨酰氧化酶(Lysyl oxidase,LOX),LOX是一种铜依赖性氨基酸氧化酶,通过催化细胞外的胶原蛋白和弹性蛋白特定位置的赖氨酰残基氧化脱氨,引起分子内和分子间的共价交联,从而形成稳定的不溶性的ECM,在肺纤维化中发挥重要作用。另外,大量的研究越来越重视LOX在细胞内的功能并提出LOX可能在EMT过程中发挥作用。我们之前的研究表明EMT在PQ诱导的肺纤维化中发挥重要作用,因此我们推断LOX是否在PQ导致的肺纤维化的EMT中发挥作用。论文主要探讨LO X在PQ中毒后导致的肺纤维化过程中与EMT的关系。本课题进行了以下研究:1.观察百草枯中毒后LOX表达、肺纤维化及EMT的情况(1)制备PQ中毒大鼠模型,苏木素-伊红(HE)和Masson染色评估肺组织病理学改变;免疫组化和Western Blot检测肺组织中LOX蛋白表达;Western Blot检测肺组织中EMT上皮标志蛋白ZO-1、E-cadherin和间质标志α-SMA、Vimentin蛋白表达。(2)制备PQ中毒体外模型,采用不同浓度的PQ处理RLE-6TN和A549细胞24h,观察细胞形态变化;采用Western Blot检测细胞上皮和间质蛋白表达变化。2.LOX在百草枯致肺纤维化过程中EMT的作用(1)制备PQ中毒大鼠模型,采用LOX抑制剂BAPN腹腔内注射处理动物后PQ染毒;苏木素-伊红(HE)和Masson染色评估肺组织病理学改变;免疫组化和Western Blot检测肺组织中LO X蛋白表达;Western Blot检测肺组织中上皮标志物、间质标志物的表达。(2)制备PQ中毒体外模型,采用LOX抑制剂BAPN处理细胞后再PQ染毒;观察细胞形态;Western Blot检测细胞中LOX、上皮标志物和间质标志物的表达。(3)制备PQ中毒体外模型,体外采用LOX基因沉默(si RNA)沉默LOX基因再进行PQ处理;观察细胞形态的变化;Western Blot检测细胞中LOX表达;Western Blot和免疫荧光检测细胞中上皮标志物和间质标志物的表达。主要研究结果如下:1.HE和Masson染色显示PQ染毒72 h后大鼠肺内大量炎性细胞浸润和胶原纤维沉积;免疫组化和Western Blot结果显示大鼠染毒72 h后肺组织内LOX增高;EMT上皮标志蛋白ZO-1和E-cadherin在大鼠中毒72 h后表达减少,间质标志α-SMA和Vimentin蛋白表达增强。这一结果提示PQ中毒后大鼠肺纤维化早期即发生,并伴随LOX表达升高及EMT的发生。2.获得PQ诱导上皮间质转化的体外模型,PQ对细胞存活率的影响具有浓度依赖性,RLE-6TN细胞在PQ浓度为80μmol/L时存活率为47.88%,A549细胞在PQ浓度800umol/L时生存率为54.96%,我们以此浓度建立RLE-6TN和A549细胞PQ中毒的模型。3.PQ处理A549和RLE-6TN细胞24 h后,细胞由圆形或卵圆形变成长梭形,LOX蛋白表达增加,EMT的上皮标志E-cadherin和ZO-1表达降低,间质标志α-SMA和Vimentin表达升高,细胞发生了EMT。4.应用LOX的抑制剂BAPN抑制大鼠LOX蛋白活性,再进行PQ处理,肺损伤及纤维化的程度减弱,EMT的程度也减弱。5.应用LOX的抑制剂BAPN抑制RLE-6TN和A549细胞LOX蛋白活性,再进行PQ处理,EMT的程度减弱;且减弱程度随抑制剂的浓度增加而增强。6.si RNA沉默A549细胞LOX基因后,再进行PQ处理24 h,发现A549细胞EMT的程度被减弱。7.单纯用抑制剂BAPN处理RLE-6TN和A549细胞和大鼠肺组织后,细胞形态没有发生变化,但EMT标志蛋白ZO-1和E-cadherin升高,间质标志α-SMA和Vimentin水平降低,类似于细胞发生了“间质向上皮的转化(mesenchymal-to-epithelial transition,MET)”基于以上结果我们推测,在PQ诱导的肺纤维化过程中,LOX的表达可以促进EMT的进展,抑制LOX的活性,EMT的程度被减弱。本项目通过研究LOX及EMT在PQ诱导肺纤维化中的作用及机制,为寻找干预PQ所致早期肺纤维化的分子靶点提供理论和实验依据,为探讨PQ治疗手段提供了新的思路。LOX与EMT的关系可能会成为治疗肺纤维化的潜在靶点。