衣原体是一类严格真核细胞内寄生、具有独特发育周期的原核细胞型微生物,可引起人和动物多种疾病,疾病表现复杂。对人致病的衣原体有沙眼衣原体、肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体等。衣原体感染已成为当今世界具有挑战性的重大公共卫生问题和社会问题,对健康和经济有着巨大的影响。为有效应对衣原体感染给公共卫生所带来的挑战,加强衣原体基础研究,深入研究其致病机制、研制衣原体疫苗成为世界范围内衣原体研究学者的重要研究课题。目前,鼠衣原体作为一种模式菌已广泛应用于人类病原性衣原体致病机制研究和衣原体疫苗研究中。一、鼠衣原体质粒缺失株的构建和鉴定背景与目的:衣原体质粒在衣原体致病中发挥重要作用,利用质粒缺失菌株和质粒携带菌株进行比较研究,可以观察研究质粒的遗传学功能,此外质粒缺失菌株还可以用作基因工程菌,广泛应用于分子生物学研究;因此构建和鉴定衣原体质粒缺失株具有重要意义。方法:采用新生霉素处理鼠衣原体、噬斑形成实验结合以Pgp3为检测标志的间接免疫荧光分析方法筛选鼠衣原体质粒缺失株,进一步采用PCR检测质粒基因,碘染色观察糖原聚集现象,动物试验检测其致病性。结果:在96孔微孔板中进行的筛选试验中,筛选到5个质粒缺失菌株。通过PCR分析证实这些菌株缺乏质粒基因,此外,在上述菌株感染的HeLa细胞中没有发现GlgA蛋白的分泌现象,也无糖原聚集。质粒缺失菌株CMUT3经阴道感染C3H/HeJ小鼠未见诱导小鼠输卵管积水。结论:成功构建了鼠衣原体质粒缺失株。二、体外传代对鼠衣原体生物学特性和致病性的影响背景与目的:尽管鼠衣原体在实验室已传代数十年,有关传代选择作用于鼠衣原体的结局尚未见报道。最近,我们对鼠衣原体质粒缺失株cmut3和野生型菌株进行传代培养,采用“无辅助感染和辅助感染”交替的方式进行体外传代培养,然后观察传代的菌株感染细胞时对离心辅助感染因素的依赖性;传代的cmg28和cmut3g40在感染hela细胞时对离心这种辅助感染因素的依赖性降低。c3h/hej小鼠经阴道感染鼠衣原体野生型菌株cmg0和传代的cmg28,阴道感染cmg28后引起的输卵管积水病理变化与cmg0感染组相比,明显降低。因此,传代的鼠衣原体在体内的致病性与体外细胞感染特性之间存在一个较大的差异。本实验的目的就是来探寻这种矛盾后面存在的可能机制。方法:体外传代培养鼠衣原体野生型菌株和质粒缺失株至一定代数,提取基因组dna,通过下一代测序技术对cmg0、cmg28、cmut3g5和cmut3g40进行全基因组测序,比较分析基因组数据;同时动物试验检测鼠衣原体的致病性。结果:通过对cmg0和cmg28进行深度基因组分析,cmg28和cmg0的基因组在3个开放读码框中存在显著差异:tc0237(q117e)替代突变(cmg28,100%;cmg0,0%),tc0668(g216*)无义突变(6.4%vs0%)和tc0668(g322r)替代突变(26%vs0%),和多个的tc0412突变多态性。吸附试验表明cmg28对细胞的吸附能力增强。cmg28和cmg0经阴道感染c3h/hej小鼠后,二者在小鼠体内有着相似的上行感染能力,而cmg28感染组致输卵管积水发生率明显降低;bio-plex200系统检测显示感染cmg28后小鼠输卵管组织中炎性细胞因子显著减少,这与输卵管炎症细胞浸润显著减少相关。tc0237(q117e)是cmg28和cmut3g40共有的突变,提示tc0237(q117e)与鼠衣原体体外吸附能力增强相关。结论:鼠衣原体TC0237(Q117E)突变增强体外吸附能力。鼠衣原体TC0237(Q117E)/TC0668(G322R)突变与鼠衣原体的致病性减弱相关联。